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猪流行性腹泻病毒分离鉴定及其M蛋白原核表达

作　者: 蒋梅
导　师: 王印
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒 病毒分离 M基因序列分析 原核表达 抗原性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水和高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,该病对全世界的养猪业造成了严重的经济损失。本研究对从遂宁地区的猪场采集的PED病料分离,然后对分离出的PEDV的M基因进行克隆、序列分析、原核表达载体构建、原核表达、多克隆抗体制备及其抗原性鉴定,为PEDV的进一步研究提供参考。1.猪流行性腹泻病毒的分离和鉴定本研究通过对采集的病料用PK-15传代细胞进行病毒的分离,通过琼脂扩散和动物回归试验鉴定病毒,结果表明四川遂宁地区此次仔猪腹泻是由PEDV引起的,该病毒能使细胞产生变亮、变圆的病变,待病毒适应细胞之后会有轻微的拉网病变；纯化后的病毒经RT-PCR检测、琼扩试验、动物回归试验鉴定为PEDV病毒,并命名为PEDV四川株SC-405,毒株的TCID50为10-2.86/0.1mL。2.猪流行性腹泻病毒M基因的克隆及序列分析本研究由已知的PEDV标准毒株CV777基因序列,采用Primer5.0设计一对特异性引物,对毒株SC-405的M基因进行扩增,然后克隆到pMD19-T载体上,进行序列测定,将得到的序列用生物信息学软件对基因极其编码的蛋白功能进行预测分析；发现其跟CV777标准毒株的M基因的核苷酸序列相似性为97.8%,氨基酸序列相似性为97.3%；同时对其他的几个相同的病料扩增病毒M基因其。从系统发育进化树来看SC-405M基因编码的氨基酸和AFZ45986(四川阿坝),ACA814]9(泰国曼谷NIAH100542-08)和BAA25380(日本东京JMe2)这三株病毒的亲缘关系较近。综合转角、无规则卷曲、柔性区域、表面可及性及亲水性区域、膜内区以及B细胞表位的特征对SC-405株的M基因编码的蛋白进行分析,推测出该蛋白的B细胞表位最可能分布在Leu15-Asn17, Trp103-Thr116, Val199-Asp205, Asp218-Glu220等区域。3.M基因的原核表达、多克隆抗体制备和抗原性检测将pMD19-T载体再与pET-28(a)进行连接,从而构建原核重组表达质粒pET-28a-PM,将其转化到表达宿主细胞BL21(DE3)中进行诱导表达,得到大小约为32kDa的重组蛋白,经过条件摸索发现诱导该细胞表达目的蛋白在IPTG浓度为0.4mmol/L30℃诱导5h后表达量达到最大；经兔抗全病毒血清作Western blot鉴定之后发现纯化后得到的蛋白具有反应原性；将纯化后的重组蛋白辅以弗氏佐剂免疫家兔获得多克隆抗体,经琼脂扩散试验证明该蛋白具有免疫原性,由此可得知,PEDV的M蛋白经原核表达出来之后具有抗原性。

全文目录


中文摘要  6-8
Abstract  8-10
中英文对照表  10-12
第一章 文献综述  12-19
  1 猪流行性腹泻病毒的病原学特性  12-19
    1.1 病原学  12-13
    1.2 PEDV的培养  13-14
    1.3 基因组结构  14-15
    1.4 流行病学  15-16
    1.5 诊断与防制  16-17
    1.6 实验研究的理论意义  17-19
第二章 病毒的分离和鉴定  19-30
  1 材料与方法  19-25
    1.1 材料  19-22
    1.2 方法  22-25
  2 结果  25-28
    2.1 猪外源病毒(RT-)PCR检测  25
    2.2 病毒的初步分离  25-26
    2.3 分离病毒的纯化后检测  26-27
    2.4 琼扩试验  27
    2.5 病毒TCID_(50)  27
    2.6 动物回归试验  27-28
  3 讨论  28-30
    3.1 实验室诊断  28-29
    3.2 病毒初步分离  29
    3.3 病毒纯化  29
    3.4 病毒鉴定  29-30
第三章 PEDV M蛋白基因克隆和序列生物信息学分析  30-45
  1 材料和方法  30-34
    1.1 材料  30-31
    1.2 方法  31-34
  2 结果  34-43
    2.1 目的基因的PCR扩增  34-35
    2.2 产物胶回收效果  35-36
    2.3 克隆质粒的PCR鉴定  36
    2.4 克隆质粒提取和双酶切鉴定  36-37
    2.5 测序结果  37-41
    2.6 序列生物信息学分析  41-43
  3 讨论  43-45
    3.1 克隆序列分析  43
    3.2 系统进化树分析  43-44
    3.3 PEDV-SC-405M基因编码蛋白的B细胞表位分析  44-45
第四章 M蛋白的原核表达及间接ELISA方法的初步建立  45-59
  1 材料和方法  45-52
    1.1 材料  45-46
    1.2 方法  46-52
  2 结果  52-56
    2.1 原核表达质粒鉴定  52-53
    2.2 原核表达产物条件优化  53-55
    2.3 蛋白纯化  55-56
    2.4 Western blot鉴定  56
    2.5 琼脂扩散鉴定免疫原性  56
  3 讨论  56-59
    3.1 基因原核表达  56-57
    3.2 诱导表达的条件优化  57
    3.3 重组蛋白抗原性检测  57-59
第五章 结论  59-60
参考文献  60-67
致谢  67-68
研究生阶段发表的论文  68

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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