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木聚糖酶1YNA及其突变体在毕赤酵母中的表达和酶特性鉴定

作　者: 李思佳
导　师: 熊海容
学　校: 中南民族大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 木聚糖酶 毕赤酵母 异源表达 酶学性质
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


木聚糖酶是可以把半纤维素中的木聚糖成分降解为低聚木糖和木糖的一类酶的总称。木聚糖酶主要存在于微生物，植物及一些低等动物中等等，其应用涉及到很多领域，如造纸、饲料、食品、能源及医药环保等方面。本研究是在原始菌株嗜热真菌所产木聚糖酶在大肠杆菌中表达的基础上，进一步将该木聚糖酶在毕赤酵母表达系统中进行表达，得到具有生物活性的木聚糖酶，并对其进行了部分酶特性的研究。实验通过设计合理的PCR引物，克隆该木聚糖酶野生型基因及其突变型基因，测序验证这两个酶基因序列，并将它们重新命名为tlx和dsb。tlx和dsb木聚糖酶基因与表达载体pPIC9γ连接转化构建重组质粒，之后将重组质粒导入到毕赤酵母GS115中进行诱导表达。利用DNS法检测发酵液上清，从中筛选出表达量高的菌株GS115-TLX与GS115-DSB，其酶活力分别为566.65IU/mL和2496.03IU/mL。并将发酵上清液做SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结果显示一条带，说明表达产物达到电泳纯级别，且表达量较高。对GS115-TLX与GS115-DSB部分酶学的分析结果显示：野生型木聚糖酶TLX最适温度为68°C，突变型木聚糖酶DSB的最适温度为75°C；TLX最适pH约为6.5，DSB在pH5～6.5之间相对酶活力能达到85%以上；在热稳定性方面，结果显示DSB比TLX其具有良好的热稳定性。DSB在75°C，pH6.5下处理30min后仍能保持60%左右的酶活力，而TLX则只有20%左右，DSB热稳定性明显高于野生型。另外，实验还通过Bradford法对野生型和突变型木聚糖酶的蛋白质进行测定，结果显示，其发酵液蛋白含量分别为1.75mg/mL和1.82mg/mL，突变株蛋白表达量要高于野生型菌株，与SDS-PAGE显示结果一致。实验最后还对GS115-DSB在发酵罐水平上诱导产酶进行了初步探索。在实验过程中对发酵液测得菌体湿最大重达到115g/L，酶活力最高达到59000IU/mL。这一结果比摇瓶水平高出很多，为以后更好的研究细胞高密度发酵打下基础。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-9
第一章 绪论  9-23
  1.1 木聚糖酶概述  10-16
    1.1.1 木聚糖酶的分子结构  11-12
    1.1.2 木聚糖酶的分类  12-14
    1.1.3 木聚糖酶的作用机制  14-15
    1.1.4 木聚糖酶的诱导机制  15
    1.1.5 木聚糖酶的酶学特性  15-16
  1.2 木聚糖酶应用  16-19
    1.2.1 在造纸工业的应用  16-17
    1.2.2 在食品工业的应用  17-18
    1.2.3 在饲料工业的应用  18-19
    1.2.4 在其他方面的应用  19
  1.3 毕赤酵母表达系统  19-20
    1.3.1 毕赤酵母表达系统  19-20
    1.3.2 表达菌株与表达载体  20
  1.4 木聚糖酶研究现状  20-22
  1.5 本文研究目的和意义  22-23
第二章 木聚糖酶 1YNA 及突变体在毕赤酵母中的表达与酶学性质的鉴定  23-50
  2.1 实验材料  23-26
    2.1.1 菌株与质粒  23
    2.1.2 引物合成  23
    2.1.3 试剂盒与工具酶  23
    2.1.4 实验仪器  23-24
    2.1.5 实验相关培养基  24
    2.1.6 实验相关溶液  24-26
  2.2 实验方法  26-39
    2.2.1 木聚糖酶 1YNA 及其突变基因的克隆  26-30
    2.2.2 木聚糖酶 1YNA 及其突变体重组表达载体的构建  30-32
    2.2.3 木聚糖酶基因在毕赤酵母中表达  32-34
    2.2.4 目标蛋白 SDS-PAGE 的分析  34-36
    2.2.5 木聚糖酶酶学性质的鉴定  36-37
    2.2.6 发酵上清液中木聚糖酶含量的检测  37-38
    2.2.7 发酵罐水平上表达木聚糖酶  38-39
  2.3 实验结果  39-48
    2.3.1 毕赤酵母重组表达载体的构建  39-43
    2.3.2 具有生物活性的木聚糖酶的筛选  43-44
    2.3.3 SDS-PAGE 的分析  44-45
    2.3.4 酶学性质的研究  45-47
    2.3.5 木聚糖酶含量的测定  47
    2.3.6 发酵罐水平上表达木聚糖酶  47-48
  2.4 本章小结  48-50
结论与展望  50-52
参考文献  52-60
致谢  60-61
附录 A 研究生期间发表的文章  61

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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