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Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达
作 者: 郭瑶
导 师: 陆兆新
学 校: 南京农业大学
专 业: 食品科学
关键词: 葡萄糖氧化酶 黑曲霉 毕赤酵母 发酵 性质
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD)系统命名为β-D-葡萄糖:氧化还原酶(EC1.1.3.4)。该酶能够利用氧气将葡萄糖氧化成葡萄糖酸并产生过氧化氢,因而具有除氧、抗氧化、去除葡萄糖以及生成葡萄糖酸的作用,被广泛应用于食品、医药、生物技术等行业。工业生产上多采用黑曲霉或青霉属的菌株发酵制备葡萄糖氧化酶,但是常出现酶活力不高、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因此,可通过基因工程技术构建葡萄糖氧化酶工程菌株,实现该酶的异源高效表达,同时简化纯化过程。本研究以实验室保藏的黑曲霉Aspergillus niger Z-25为出发菌株,克隆到葡萄糖氧化酶基因,并将该基因整合至毕赤酵母Pichia pastoris的染色体基因组上,实现了葡萄糖氧化酶的高效表达。同时,对重组毕赤酵母在摇瓶和发酵罐水平的产酶条件、重组葡萄糖氧化酶的纯化过程以及酶学性质进行了研究。主要内容如下:1.黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析。以黑曲霉菌株Aspergillus niger Z-25的基因组DNA为模板,通过PCR扩增到1818 bp的葡萄糖氧化酶完整开放阅读框,在GenBank数据库中的登录号为FJ979866。序列分析表明,该葡萄糖氧化酶的核苷酸序列与A. niger NRRL-3和A. niger ATCC 9029的葡萄糖氧化酶核苷酸序列(登录号分别为X16061和J05242)相似性达93%,推导的氨基酸序列相似性达97%,共有17个氨基酸残基发生了置换。在编码A. niger Z-25葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中,含有由22个氨基酸残基组成的信号肽和583个氨基酸残基组成的成熟肽,以及3个位于保守位点的半胱氨酸残基(Cys164、Cys206、Cys521)和7个潜在的N-糖基化位点Asn-X-Thr/Ser (Asn89、Asn161、Asnl68、Asn258、Asn355、Asn388、Asn473)。2.黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达。将A.niger Z-25葡萄糖氧化酶基因与毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA连接,构建重组表达载体pPICZaA-GOD。经限制性内切酶Pme I线性化后,电击转化毕赤酵母SMD1168,利用zeocin抗性梯度筛选、PCR鉴定,挑取6株重组酵母单菌落进行诱导培养。通过测定发酵上清液的酶活,最终筛选到一株高效表达葡萄糖氧化酶的重组酵母SMD1168/GOD.3.重组毕赤酵母在摇瓶和发酵罐水平的产酶条件研究。确定重组酵母SMD1168/GOD的摇瓶培养条件为:在YPG培养基中培养菌体至对数生长期(OD约为6.0)后,转入pH 5.0的BMMY培养基中,在30℃、240 rpm条件下诱导,每24 h添加甲醇至终浓度为2.0%。诱导168 h后,葡萄糖氧化酶的活力达40 U/mL左右,是出发菌株A. niger Z-25的20倍。在19 L发酵罐中高密度培养SMD1168/GOD时,控制温度29.5。C、培养基pH 5.5、溶氧25%以上,经过20.5 h的甘油分批阶段和7.5 h的甘油流加阶段后,开始甲醇流加培养。诱导142 h后,重组葡萄糖氧化酶的活力达522.5 U/mL,是摇瓶发酵水平的13倍。4.重组葡萄糖氧化酶的分离纯化和酶学性质研究。重组葡萄糖氧化酶粗酶液经60-90%饱和度的(NH4)2SO4沉淀后,得到电泳纯的葡萄糖氧化酶,比活力为153.46U/mg,回收率达到95.6%,纯化了3.34倍。经SDS-PAGE检测,重组葡萄糖氧化酶亚基的分子量约为94 kDa,糖基化程度为31.9%。重组葡萄糖氧化酶的最适作用温度和pH分别为40℃和6.0,在温度不超过40℃时能保持90%以上的酶活力,在pH值为4.0-8.0的范围内维持稳定。Ag+对重组葡萄糖氧化酶的活性具有明显的促进作用,Cu2+、Pb2+对重组酶的活性具有强烈的抑制作用,Fe3+对酶活有微弱的抑制作用。根据Lineweaver-Burk双倒数法计算得到重组葡萄糖氧化酶的Km和Kcat值分别为16.95mM和484.26 s-1。
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全文目录
摘要 7-9ABSTRACT 9-11缩略词表 11-12表格索引 12-13图形索引 13-15第一章 文献综述 15-29 1 葡萄糖氧化酶研究进展 15-21 1.1 葡萄糖氧化酶简介 15-16 1.2 葡萄糖氧化酶的生产菌种 16 1.3 葡萄糖氧化酶活力的测定 16-17 1.4 葡萄糖氧化酶的应用 17-20 1.4.1 食品和饮料生产 17-18 1.4.2 酿酒类生产 18 1.4.3 葡萄糖酸的生产 18-19 1.4.4 口腔清洁 19 1.4.5 纺织品制造 19 1.4.6 生物传感器 19 1.4.7 生物燃料电池 19-20 1.5 葡萄糖氧化酶的分子生物学研究进展 20-21 2 巴斯德毕赤酵母表达系统 21-26 2.1 毕赤酵母表达宿主菌 22-23 2.2 毕赤酵母表达载体 23-24 2.3 影响外源蛋白表达的主要因素 24-26 2.3.1 外源基因的特性 25 2.3.2 启动子的选择 25 2.3.3 信号肽的选择 25-26 2.3.4 蛋白酶的降解 26 2.3.5 发酵条件的影响 26 3 本研究的目的意义和内容 26-29第二章 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达 29-67 1 材料与方法 29-43 1.1 材料 29-32 1.1.1 菌株与质粒 29 1.1.2 主要工具酶与试剂 29 1.1.3 主要仪器和设备 29-30 1.1.4 培养基和主要试剂的配制 30-32 1.1.4.1 培养基 30-31 1.1.4.2 培养基贮存液 31 1.1.4.3 黑曲霉和酵母基因组DNA提取的相关试剂 31 1.1.4.4 碱裂解法提取质粒的相关试剂 31-32 1.1.4.5 电击转化毕赤酵母的相关试剂 32 1.1.4.6 葡萄糖氧化酶活性测定的相关溶液 32 1.2 方法 32-43 1.2.1 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析 32-35 1.2.1.1 Aspergillus niger Z-25基因组DNA的提取 32-33 1.2.1.2 引物设计与PCR扩增 33 1.2.1.3 PCR产物的纯化及其与pMD19-T载体的连接 33 1.2.1.4 大肠杆菌感受态制备和连接产物的转化 33-34 1.2.1.5 阳性克隆的筛选与重组质粒的提取 34-35 1.2.1.6 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的序列分析 35 1.2.2 分泌型表达载体pPICZαA-GOD的构建 35-37 1.2.2.1 引物设计与PCR扩增 35 1.2.2.2 PCR产物和表达载体pPICZαA的双酶切 35-36 1.2.2.3 葡萄糖氧化酶基因与表达载体pPICZαA的连接以及连接产物的转化 36 1.2.2.4 阳性克隆的筛选与鉴定 36-37 1.2.2.5 重组质粒pPICZαA-GOD的测序 37 1.2.3 重组表达载体pPICZαA-GOD电击转化毕赤酵母SMD1168 37-38 1.2.3.1 重组质粒pPICZaA-GOD的大量提取与线性化 37 1.2.3.2 毕赤酵母感受态细胞的制备 37-38 1.2.3.3 重组质粒pPICZαA-GOD的电击转化 38 1.2.4 多拷贝转化子的筛选与鉴定 38-39 1.2.4.1 酵母转化子的zeocin抗性筛选 38 1.2.4.2 酵母基因组DNA的提取 38 1.2.4.3 酵母转化子的PCR鉴定 38-39 1.2.5 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的诱导表达 39-40 1.2.5.1 重组葡萄糖氧化酶的诱导表达 39 1.2.5.2 葡萄糖氧化酶的活力测定 39 1.2.5.3 SDS-PAGE检测 39 1.2.5.4 蛋白含量测定 39-40 1.2.6 重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的发酵条件研究 40-41 1.2.6.1 摇瓶发酵产酶条件的研究 40-41 1.2.6.2 发酵罐高密度培养条件的研究 41 1.2.7 重组葡萄糖氧化酶的纯化以及酶学性质的研究 41-43 1.2.7.1 重组葡萄糖氧化酶的粗酶液制备 41 1.2.7.2 重组葡萄糖氧化酶的分离纯化 41-42 1.2.7.3 重组葡萄糖氧化酶最适反应温度和温度稳定性的测定 42 1.2.7.4 重组葡萄糖氧化酶最适作用pH和pH稳定性的测定 42 1.2.7.5 金属离子对重组葡萄糖氧化酶活性的影响 42 1.2.7.6 重组葡萄糖氧化酶动力学参数的测定 42-43 2 结果与分析 43-61 2.1 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析 43-46 2.1.1 Aspergillus niger Z-25基因组DNA的提取 43 2.1.2 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆 43-45 2.1.3 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的序列分析 45-46 2.2 分泌型表达载体pPICZαA-GOD的构建 46-49 2.2.1 葡萄糖氧化酶基因的PCR扩增 46-47 2.2.2 重组表达载体pPICZαA-GOD的构建与鉴定 47-49 2.3 表达载体pPICZαA-GOD电击转化毕赤酵母和酵母转化子的筛选 49-52 2.3.1 重组表达载体pPICZαA-GOD的线性化 49-50 2.3.2 酵母转化子的zeocin抗性筛选 50-51 2.3.3 酵母转化子的PCR鉴定 51-52 2.4 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达 52-55 2.4.1 重组毕赤酵母菌株表达葡萄糖氧化酶的活力曲线测定 52-53 2.4.2 重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的摇瓶发酵条件研究 53-55 2.4.3 发酵罐高密度培养条件的研究 55 2.5 重组葡萄糖氧化酶的纯化以及酶学性质的研究 55-61 2.5.1 重组葡萄糖氧化酶的分离纯化和分子量的测定 55-58 2.5.2 温度对重组葡萄糖氧化酶活性和稳定性的影响 58 2.5.3 pH对重组葡萄糖氧化酶活性和稳定性的影响 58-59 2.5.4 金属离子对重组葡萄糖氧化酶活性的影响 59-60 2.5.5 重组葡萄糖氧化酶的动力学参数测定 60 2.5.6 重组酶与天然酶的性质比较 60-61 3 讨论 61-66 3.1 毕赤酵母感受态细胞的制备和电击转化 61-62 3.2 多拷贝转化子的筛选与鉴定 62 3.3 信号肽的选择 62-63 3.4 重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的发酵条件 63-64 3.5 重组葡萄糖氧化酶的分离纯化 64 3.6 不同来源的葡萄糖氧化酶的性质比较 64-65 3.7 进一步提高重组葡萄糖氧化酶活力的方法 65-66 4 结论 66-67参考文献 67-75研究生期间发表的研究论文 75-77致谢 77
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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