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转萝卜过氧化物酶基因RsPrx1酵母表达条件优化及其抗性机理研究

作　者: 杨静
导　师: 王林嵩
学　校: 河南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 萝卜过氧化物酶基因RsPrx1 转基因毕赤酵母 优化培养基 盐胁迫 抗性基因
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


植物过氧化物酶的功能多样,在植物的生长过程中发挥着重要的作用,本实验采用转基因技术研究植物过氧化物酶的功能,一方面更深入的了解了目的基因的功能,另一方面也为目的基因的工业化应用提供了理论依据。为更好地研究植物过氧化物酶生物效应的多样性和复杂性提供了一个新的思路和方法。本实验选用已经成功构建转萝卜过氧化物酶基因RsPrx1的酵母菌株(GSRP25)为研究对象,对转基因酵母培养基优化,添加0.5g/L亚铁血红素和0.5ml/L微量元素,经过优化后的BMMY培养基培养的GSRP25的最大分泌过氧化物酶酶活达到30.9U/mL,是普通BMMY培养基所获得酶活量的5.92倍,经SDS-PAGE电泳检测出目的条带的表达量也相对显著增强。其次,对转基因酵母GSRP25进行抗性方面的研究,实验结果表明:诱导—不诱导培养条件下转萝卜过氧化物酶RsPrx1酵母的抗盐、抗氧化及抗高温和低温功能高于不诱导—诱导培养条件。其中,抗盐和抗高温功能最强。因此对GSRP25进行抗盐方面的深入研究。从菌液浓度(OD600)、POD酶活和可溶性蛋白含量等生理生化指标可以看出转基因酵母GSRP25的抗盐胁迫能力要强于野生型的毕赤酵母GS115。从代谢机理分析,提取酵母总RNA,采用半定量RT-PCR的方法进行抗性基因表达鉴定,结果证明:抗性基因HSP12、CTT1在两种菌株中都有不同程度的表达,但在GSRP25中的表达量都要高于GS115,说明RsPrx1在酵母中不仅起到了保护酵母抗盐胁迫的作用,还能够在一定程度上对酵母自身抗性基因进行转录水平调控,增加它们的表达量,提高酵母的抗盐胁迫能力。综上所述,本实验不仅通过优化培养基提高了RsPrx1基因的表达量,更重要的是证明了RsPrx1基因具有抗盐、抗氧化、抗高温的作用,以及提高酵母抗盐性的明显效应。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
缩略语表  6-9
第一章 前言  9-17
  1.1 过氧化物酶的研究现状  9-10
  1.2 毕赤酵母表达外源过氧化物酶的优化策略  10-12
    1.2.1 毕赤酵母表达系统的优势  10-11
    1.2.2 诱导表达培养BMMY 的优化  11-12
  1.3 外源基因诱导条件的研究现状  12-13
  1.4 酵母抗性研究分析  13-15
    1.4.1 盐胁迫下酵母的应答机制  13-15
    1.4.2 氧化胁迫和温度胁迫下酵母的作用机制  15
  1.5 研究目的和内容  15-17
    1.5.1 研究目的  15-16
    1.5.2 研究内容  16-17
第二章 材料与方法  17-27
  2.1 材料  17-20
    2.1.1 主要实验材料  17
    2.1.2 主要试剂盒及试剂  17
    2.1.3 储液和培养基  17-19
    2.1.4 主要仪器设备  19-20
  2.2 实验方法  20-27
    2.2.1 转基因酵母的遗传稳定性鉴定  20-22
    2.2.2 转基因酵母诱导表达条件的优化  22-24
    2.2.3 GSRP25和GS115的抗性试验  24
    2.2.4 盐处理对转基因酵母代谢的影响  24-27
第三章 结果  27-41
  3.1 转基因毕赤酵母的遗传稳定性鉴定  27-28
    3.1.1 酵母总RNA 提取图谱  27-28
    3.1.2 RT-PCR 扩增目的基因RsPrx1  28
  3.2 转基因酵母GSRP25 诱导表达条件优化结果  28-31
    3.2.1 优化培养基对转基因酵母GSRP25 生理生化指标的影响  28-30
    3.2.2 SDS-PAGE 检测目的蛋白  30-31
  3.3 GSRP25 的抗盐实验  31-32
  3.4 GSRP25 的抗氧化实验  32
  3.5 GSRP25 的温度耐受性实验  32-34
    3.5.1 4℃低温试验  32-33
    3.5.2 40℃高温试验  33-34
  3.6 不同盐浓度处理对转基因酵母GSRP25 细胞内生化指标的影响  34-41
    3.6.1 菌液浓度（OD600）  34
    3.6.2 POD 酶活的变化  34-37
    3.6.3 POD 同工酶电泳图谱  37-38
    3.6.4 SDS-PAGE 蛋白电泳图谱  38-39
    3.6.5 盐处理酵母代谢途径中相关基因的RT-PCR  39-41
第四章 分析与讨论  41-47
  4.1 诱导表达培养基BMMY 的优化  41-42
  4.2 不同的培养方式研究外源萝卜过氧化物酶基因RsPrx1  42-43
  4.3 萝卜过氧化物酶基因RsPrx1 对毕赤酵母抗性的影响  43-45
  4.4 盐胁迫下酵母基因组转录应答模式  45-47
第五章 结论  47-49
参考文献  49-57
致谢  57-59
攻读学位期间发表的学术论文目录  59-60

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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