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香菇漆酶基因在毕赤酵母中的表达及对三苯甲烷类染料脱色的研究

作　者: 周超
导　师: 赵明文；姚泉洪
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 香菇漆酶毕赤酵母三苯甲烷类染料脱色介体
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

漆酶是一类含铜的多酚氧化酶,一般含有4个铜原子,这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用。漆酶能催化氧分子4个电子还原成水,并且伴随着一些酚类和芳香类底物的氧化。它是白腐真菌三大木质素降解酶系统中的一种,由于其氧化底物时无需大量的H202作为辅助剂,且能把分子氧直接还原为水,不会造成二次污染的特点,使得它具有更大的潜在的工业价值,常被应用于环境有机污染物的降解、染料的脱色、造纸工业的漂白以及生物检测等领域。香菇作为一种白腐真菌,能够分泌出较多的漆酶,并对染料有脱色作用。但是香菇菌株在人工或者天然培养基上生长时漆酶合成水平仍然偏低,而且培养较为困难,发酵产物成分复杂,也不便于漆酶的大规模工业化制备。因此,开展真菌漆酶的基因克隆及在异源蛋白高效表达,是解决漆酶酶源短缺的重要途径。根据基因库香菇漆酶基因LeLcc1的序列(登录号：AB035409),并以提取的香菇cDNA为模板,设计7对引物采用定点突变技术克隆漆酶基因,同时消除基因内部的BamH I和Sac I位点及5’端18个氨基酸组成的自身分泌信号肽序列,得到编码500个氨基酸的1503 bp漆酶基因序列,并插入到表达载体pPIC9K的多克隆位点中,构建得到重组质粒pYM8837。表达质粒含有酿酒酵母α信号肽序列、克隆的LeLcc1基因以及终止子。重组质粒以BglⅡ线性化后电转化进GS115菌株。SDS-PAGE分析显示重组漆酶分子量大小约为62 KD,糖基化率为15.4%。纯化后的重组漆酶以ABTS为底物进行酶学性质研究,结果表明重组漆酶在最适pH 2.4,在30℃条件下比较稳定,这与野生型漆酶性质(Lcc1)不同,但是在其它酶学性质方面相似。它们的最适温度是45℃,金属离子如Ba2+、Ca2+、Zn2+和A13+对它们的活性都有抑制作用,潜在的抑制剂如DTT和NaN3能强烈的抑制它们的活性,蛋白质螯合剂—EDTA对它们活性仅有微弱的抑制作用。L-Alanine作为重组漆酶在毕赤酵母表达时维持pH稳定的添加剂,具有促进漆酶酶活的作用。另外对重组漆酶摇瓶发酵条件进行了初步研究,为下一步大规模的发酵提供参考。结果表明BMM培养基最佳的诱导条件添加终浓度为1.5%甲醇和0.2 mM Cu2+。我们研究了纯重组漆酶脱色孔雀石绿、结晶紫和亮绿,发现脱色效果不是很明显,且随着pH的上升染料脱色率在下降。ABTS是最常用的合成介体,我们对漆酶ABTS介体系统脱色染料条件进行了优化：孔雀石绿最佳的脱色条件是pH 2.4-3.0、温度是40℃和10μMABTS;结晶紫最佳脱色条件是pH 2.4-3.6、温度是45℃和10μMABTS;亮绿最佳脱色条件pH 3.0-4.0、温度是50℃和4μM。我们以孔雀石绿为底物从8种自然酚类化合物中,筛选出乙酰丁香酮和丁香醛是最有效的介体,它们18h后几乎能将孔雀石绿完全脱色,结晶紫和亮绿的脱色率也达到65%。pH和介体浓度对染料的脱色有影响,孔雀石绿和结晶紫最适pH是4.0,而亮绿的最适pH是3.6；三种染料都是在介体/染料比例是6/1时达到最大脱色率。另外,HBT是一种最常见的漆酶合成介体,在本实验中发现对三种染料的脱色都没有起到介导作用。

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目录 4-8摘要 8-10ABSTRACT 10-12名词缩写 12-13第一章文献综述 13-29 1. 白腐菌漆酶 13-20 1.1 漆酶的概念 13 1.2 漆酶的来源和分布 13 1.3 漆酶特性 13-18 1.4 漆酶的主要用途 18-20 2. 毕赤酵母表达系统 20-23 2.1 毕赤酵母表达要素 20-21 2.2 影响外源基因在酵母中表达的因素 21-23 3. 研究意义 23-24 参考文献 24-29第二章香菇漆酶基因克隆表达及重组漆酶酶学性质 29-47 第一节香菇漆酶基因的克隆表达 30-40 1. 材料 30 1.1 菌株与质粒 30 1.2 试剂 30 1.3 培养基与缓冲溶液 30 1.4 主要仪器 30 2. 方法 30-36 2.1 引物设计及扩增香菇漆酶基因 30-32 2.2 表达载体pYM8837的构建及转化毕赤酵母 32-33 2.3 表达载体pYM8837在大肠杆菌DH5a中扩增 33 2.4 毕赤酵母的电击转化 33-34 2.5 重组毕赤酵母转化子的鉴定 34 2.6 重组毕赤酵母的诱导表达 34 2.7 漆酶酶活测定方法 34-35 2.8 重组漆酶的纯化和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 35-36 3. 结果与分析 36-39 3.1 香菇漆酶基因的克隆 36-37 3.2 重组毕赤酵母载体的构建及酶切鉴定 37-38 3.3 重组毕赤酵母转化子的鉴定 38 3.4 重组毕赤酵母表达产物SDS-PAGE分析 38-39 4. 讨论 39-40 第二节重组漆酶酶学性质 40-47 1. 材料 40 2. 方法 40-41 2.1 酶活的测定方法 40 2.2 漆酶最适作用pH测定 40 2.3 漆酶的最适反应温度测定 40 2.4 酶pH稳定性的测定 40-41 2.5 酶对温度的稳定性测定 41 2.6 几种金属离子对酶活的影响 41 2.7 几种潜在抑制剂对酶活的影响 41 3. 结果与分析 41-44 3.1 漆酶最适作用pH值和pH稳定性 41-42 3.2 漆酶的最适反应温度 42 3.3 漆酶的热稳定性研究 42-43 3.4 几种金属离子对漆酶活力的影响 43 3.5 几种潜在抑制剂对漆酶活性的影响 43-44 4. 讨论 44-45 5. 本章小结 45-47第三章重组漆酶摇瓶表达条件的初步研究 47-53 1. 材料 48 1.1 菌株 48 1.2 培养基 48 1.3 主要仪器 48 2. 方法 48-49 2.1 漆酶活性测定方法 48 2.2 酵母细胞密度分析 48 2.3 种子活化方法 48 2.4 漆酶重组酵母的诱导表达实验 48-49 3. 结果 49-50 3.1 添加不同浓度的甲醇对重组酵母漆酶表达活性的影响 49 3.2 添加不同浓度Cu~(2+)对重组酵母漆酶表达活性的影响 49-50 4. 讨论 50-51 5. 本章小结 51-53第四章漆酶介体系统脱色三苯甲烷类染料 53-91 第一节重组漆酶对孔雀石绿脱色的研究 54-67 1. 材料 54 1.1 化学试剂 54 1.2 酶及染料 54 1.3 实验仪器 54 2. 方法 54-55 2.1 染料溶液的降解方法 54 2.2 染料溶液的脱色分析方法 54 2.3 孔雀石绿的最大吸收波长 54 2.4 孔雀石绿HPLC分析方法 54-55 3. 结果 55-65 3.1 纯漆酶与孔雀石绿脱色 55 3.2 漆酶ABTS介体体系对孔雀石绿脱色的研究 55-57 3.3 自然酚类化合物作为漆酶介体对孔雀石绿脱色的研究 57-60 3.4 ABTS、乙酰丁香酮和丁香醛脱色孔雀石绿扫描图 60-61 3.5 孔雀石绿降解高效液相色谱分析 61-65 4. 讨论 65-67 第二节重组漆酶对结晶紫脱色研究 67-79 1. 材料 67 1.1 化学试剂 67 1.2 酶及染料 67 1.3 实验仪器 67 2. 方法 67-68 2.1 染料溶液的降解方法 67 2.2 染料溶液的脱色分析方法 67 2.3 结晶紫的最大吸收波长 67 2.4 结晶紫HPLC分析方法 67-68 3. 结果 68-77 3.1 纯漆酶与结晶紫脱色 68 3.2 漆酶ABTS介体体系对结晶紫的研究 68-70 3.3 自然酚类化合物作为漆酶介体对结晶紫脱色的研究 70-72 3.4 ABTS,乙酰丁香酮和丁香醛脱色结晶紫扫描图 72-73 3.5 结晶紫降解高效液相色谱分析 73-77 4. 讨论 77-79 第三节重组漆酶对亮绿脱色研究 79-91 1. 材料 79 1.1 化学试剂 79 1.2 酶及染料 79 1.3 实验仪器 79 2. 方法 79 2.1 染料溶液的降解方法 79 2.2 染料溶液脱色分析方法 79 2.3 亮绿的最大吸收波长 79 2.4 亮绿HPLC分析方法 79 3. 结果 79-88 3.1 纯漆酶与亮绿脱色 80 3.2 漆酶ABTS介体体系对亮绿的研究 80-82 3.3 自然酚类化合物作为漆酶介体对亮绿脱色的研究 82-84 3.4 ABTS,乙酰丁香酮和丁香醛脱色亮绿扫描图 84-85 3.5 亮绿高效液相色谱分析 85-88 4. 讨论 88-89 5. 本章小结 89-91全文总结 91-93参考文献 93-97附录 97-99致谢 99

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