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稗草谷胱甘肽转移酶基因（EcGSTs）的克隆和表达分析

作　者: 王笑
导　师: 管荣展
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物
关键词: 稗草 EcGSTs 基因克隆 原核表达 qPCR
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
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内容摘要


杂草通过与油菜、水稻、小麦等作物竞争养分、水分、光照和空间等非生物因素,影响作物的产量和品质。除草剂的使用在减轻劳动强度和提高工作效率的同时,也可能会对作物产生伤害。目前,培育抗除草剂作物新品种是解决这一矛盾的关键。谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs; EC2.5.1.18)普遍存在于植物体内,在植物解毒代谢、逆境胁迫等方面有重要作用。恶性杂草---稗草的多抗性尤为突出,为了深入揭示其抗性机理,发掘抗除草剂基因。本研究从多抗性稗草(Echinochloa crusgalli (L.) Beauv.)中,克隆得到两个GSTs基因(EcGSTZ1和EcGSTF1),并完成了生物信息学分析、原核表达分析、荧光定量分析和酶活性测定等工作,主要研究结果如下：1. EcGSTs:基因克隆：克隆得到的两个基因中,EcGSTZ1基因全长747bp,开放阅读框为639bp(含终止密码子),编码氨基酸212个,理论分子量为23.67KDa; EcGSTF1基因全长661bp,开放阅读框为645bp(含终止密码子),编码氨基酸214个,理论分子量为23.79KDa。经PSI-BLAST对比分析和系统发生树分析表明,EcGSTZ1基因属于Zeta家族,EcGSTF1基因属于Phi家族。2.原核表达分析：成功构建了pET28b-EcGSTF1和pET28b-EcGSTZ1勺表达载体,经IPTG诱导后,两种表达载体均获得表达,随着诱导时间的延长,表达量增加,表达条带大小和理论值相同。3. qPCR分析：以β-Actin基因作为内参,qPCR分析了除草剂处理前后不同抗性稗草的EcGSTs基因表达情况,发现两种基因均有表达；施药后表达量高于施药前,Phi类基因表达量高于Zeta类基因,多抗性稗草表达量高于敏感性陴草。这说明EcGSTs基因的表达与解毒代谢关系密切。4. GSTs活性测定：GSTs活性研究结果显示,施药处理前,多抗性稗草GSTs活性略高于敏感性稗草；施药后短时间内,两种稗草GSTs活性都呈下降趋势,敏感性稗草反应迟缓,多抗性稗草反应较迅速；随着时间的延长,多抗性稗草GSTs活性持续上升,而敏感性稗草GSTs活性呈先上升后下降趋势；最终多抗性稗草GSTs活性高于敏感性稗草。分析说明GSTs活性与杂草对除草剂的抗性有关,不同抗性稗草GSTs活性差异是引起除草剂代谢能力不同的重要原因。综上所述,通过:qPCR分析发现多抗性稗草EcGSTs基因表达量高于敏感性稗草,同时多抗性稗草GSTs酶活性高于敏感性稗草,说明GSTs基因对除草剂有解毒作用,并且克隆得到的两个EcGSTs基因可成功进行原核表达,为进一步解析GSTs基因在植物体内对外源有毒物质的解毒机制提供了重要基础。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章 文献综述  10-20
  1.1 抗除草剂基因来源  10-12
  1.2 植物对除草剂的抗性机制  12-13
  1.3 抗除草剂基因在作物中的应用  13-14
  1.4 抗除草剂谷胱甘肽转移酶基因研究进展  14-19
    1.4.1 植物谷胱甘肽转移酶的类别  15
    1.4.2 谷胱甘肽转移酶的结构及组成  15-16
    1.4.3 谷胱甘肽转移酶的催化机制  16-17
    1.4.4 植物谷胱甘肽转移酶的功能  17-18
    1.4.5 Phi类和Zeta类谷胱甘肽转移酶的功能  18-19
  1.5 本研究的目的与意义  19-20
第二章 稗草GSTS基因的克隆  20-30
  2.1 材料与方法  20-24
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 培养基  20
    2.1.3 总RNA的提取  20-21
    2.1.4 以总RNA为模板合成cDNA第一链  21
    2.1.5 引物设计  21-22
    2.1.6 目的片段的扩增  22
    2.1.7 琼脂糖凝胶产物纯化及胶回收产物加“A”反应  22-23
    2.1.8 克隆载体的构建和测序  23-24
    2.1.9 GSTs基因的生物信息学分析  24
  2.2 结果与分析  24-29
    2.2.1 总RNA提取  24-25
    2.2.2 EcGSTs基因目的片段的扩增  25-26
    2.2.3 EcGSTs基因克隆载体的构建与鉴定  26-27
    2.2.4 EcGSTs基因的序列分析  27-29
  2.3 讨论  29-30
第三章 除草剂抗性稗草的ECGSTS基因表达分析  30-40
  3.1 材料与方法  30-33
    3.1.1 植物材料  30
    3.1.2 试剂和仪器  30
    3.1.3 GSTs基因的原核表达分析  30-32
    3.1.4 GSTs基因的定量表达分析  32
    3.1.5 GSTs酶活的测定  32-33
  3.2 结果与分析  33-37
    3.2.1 EcGSTs基因的原核表达分析  33-35
    3.2.2 EcGSTs基因的qPCR分析  35-36
    3.2.3 GSTs酶活性比较分析  36-37
  3.3 讨论  37-40
全文总结  40-42
创新之处  42-44
参考文献  44-52
致谢  52

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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