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IL-12的抗辐射作用及相关机制研究

作　者: 郭万军
导　师: 袁守军
学　校: 安徽医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 重组小鼠白细胞介素12 抗辐射作用存活率骨髓造血机能间充质干细胞重组人白细胞介素12 淋巴细胞基因修复 ACT-001 细胞凋亡抗肿瘤作用
分类号: Q274
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

rmIL-12对γ-射线照射后小鼠存活状况、骨髓造血机能和体外小鼠骨髓间充质干细胞存活的影响。100只小鼠按体重随机分为照射对照组、阳性对照组、rmIL-12组（200ng/只，100ng/只，50ng/只）共5组，每组20只，雌雄各半。用⁶⁰Co射线照射源，小鼠全身照射8.0Gy用于存活率实验研究。50只雌性小鼠，分为同样5组，全身4.0Gy照射用于对造血功能影响的研究。均在照射前24h、1h各给药一次，照射后每天给药一次，连续7天，给药途径为皮下注射。MTT方法观察在不同辐射剂量下rmIL-12对体外培养的骨髓间充质干细胞生存的影响。结果表明，rmIL-12可明显提高8.0Gy⁶⁰Co γ射线照射小鼠30天活存率，使生存曲线（KaplanMeier曲线）显著增高及右移；在⁶⁰Co γ射线辐射剂量为4.0Gy时，rmIL-12对小鼠的外周血中白细胞（WBC）、血小板（PLT）和网织红细胞（RET）计数增高和恢复提前，骨髓DNA含量也显著高于对照组；同时在0.125ng/mL³2ng/mL浓度范围内，在体外可观察到rmIL-12对⁶⁰Co γ射线辐射的小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生存有保护效应。恒河猴20只，分为四组，每组雌雄各半。正常对照组2只，照射对照组及rhIL-12低剂量组和高剂量组各6只，后两组动物分别于照射前24h和1h，照射后每天一次，连续9天皮下注射rhIL-12剂量为5和0.5μg/kg。⁶⁰Co辐射剂量为3.0Gy（222cGy/min）。受试动物辐照后，一般表现和血液系统各指标的变化符合骨髓型放射病的特征，主要表现为外周血白细胞、红细胞和血小板数的下降。试验过程中未观察到受试药物rhIL-12对三系细胞计数下降的抑制或者遏制作用，高剂量组甚至加重。但在血象恢复阶段，白细胞总数曲线，高剂量组高于照射对照组；网织红细胞和血小板计数曲线，高、低剂量组均高于照射对照组。在实验后期的淋巴细胞畸变分析，低剂量组动物的淋巴细胞畸变率明显低于辐射对照组。rmIL-12能够提高⁶⁰Co γ射线辐射下小鼠的存活率以及促进造血功能的恢复，对小鼠骨髓间充质干细胞的生存有保护作用；rhIL-12对⁶⁰Co辐射恒河猴所致急性放射病的初步研究，受试药物对骨髓造血机能的恢复有一定的促进作用，对淋巴细胞基因组的修复也有一定的促进作用。ACT-001对脑神经胶质瘤细胞的抗肿瘤药效学及相关机制进行初步探讨研究。利用MTT法检测不同浓度的ACT-001对C6细胞和U87MG细胞的体外药效学研究；流式细胞技术比较两株细胞在不同浓度ACT-001作用下，对细胞周期分布及细胞凋亡的影响；采用C6/Wistar大鼠原位肿瘤模型，对不同浓度的ACT-001进行体内抗肿瘤药效学研究，观察荷瘤鼠的日常表现、体重变化及存活状况并做病理切片HE染色；最后采用RT-PCR方法检测C6细胞及荷瘤鼠脑组织中相关基因Nestin以及凋亡基因Bax和Bcl-2的表达情况。MTT结果显示，ACT-001对受试细胞C6和U87MG的生长抑制效应呈现出良好的剂量依赖关系，重复试验结果一致，受试药物设置浓度基本涵盖了药物效应窗口，半数抑制浓度（IC50）范围分别为27.2²8.6μM和20.6²7.9μM。流式细胞术分析，随着ACT-001作用浓度的增加，C6和U87MG细胞的凋亡率也逐渐增加，同时还能诱导诱导C6细胞周期G0/G1、G2/M期阻滞，但不同浓度间差异并不显著，对U87MG细胞周期无明显影响。体内实验结果显示，ACT-001能够抑制C6细胞在大鼠脑内的生长，第一次实验中ACT-001（80mg/kg和160mg/kg）的抑制率分别为69.4%（P<0.01）和63.9%（P<0.01），模型对照组死亡5只动物的同时，80mg/kg组也死亡1只动物，160mg/kg组实验后期体重也有所下降，并未显示出良好的量效关系，因此在第二次试验中ACT-001剂量调整为25、50、100mg/kg，抑制率分别为59.9%（P<0.01）、78.7%（P<0.001）及87.5%（P<0.001），模型对照组死亡5只动物时，中、低剂量组各死亡1只动物，实验后期体重仍有所增加，既呈现出较好的量效关系，又增加了动物的存活率（P<0.05），HE染色结果显示对照组大鼠颅内肿瘤细胞增殖活跃，边缘有浸润现象，而ACT-001各给药组均较对照组症状减轻，基本接近正常。RT-PCR结果显示，Quantity one软件进行灰度分析，荷瘤大鼠脑组织高表达Nestin基因，而正常脑组织低表达，同时不同浓度的ACT-001促进凋亡基因Bax和抑制基因Bcl-2在C6细胞内的表达。ACT-001在体外可抑制C6细胞和U87MG细胞的生长，促进细胞的凋亡以及诱导周期发生变化；在体内，它能够明显抑制C6细胞在大鼠脑内的生长，100mg/kg组效果最好，在抑制细胞增长的同时，还能延长动物的生存期及增加存活率，并未产生药物毒性；ACT-001还能诱导凋亡基因Bax和Bcl-2的表达。

全文目录

英文缩略词(Abbreviations)  5-7
第一部分：IL-12 的抗辐射作用及相关机制研究  7-77
  摘要  8-10
  Abstract  10-12
  引言  12-14
  材料与方法  14-20
    实验材料  14-16
    实验方法  16-20
      1. rmIL-12 对60Co 照射 8.0Gy 小鼠存活率影响的抗辐射作用研究  16
      2. rmIL-12 对60Co 照射 4.0Gy 小鼠骨髓造血机能的影响研究  16-17
      3. 股骨骨髓的DNA数和细胞数量  17
      4. MSCs 细胞培养及形态观察  17
      5. MSCs 细胞的纯化  17
      6. 体外 MTT 法测定受照射细胞 MSCs 的细胞活度  17-18
      7. rhIL-12 对60Co 照射恒河猴的抗辐射作用预试研究  18-19
      8. 统计学分析  19-20
  结果  20-69
  讨论  69-73
  结论  73-74
  参考文献  74-77
第二部分：脑神经胶质瘤原位模型的建立及 ACT-001 的抗肿瘤药效学相关机制研究  77-121
  摘要  78-80
  Abstract  80-82
  引言  82-84
  材料与方法  84-95
    实验材料  84-87
    实验方法  87-95
      1. 细胞培养  87
      2. 体外 MTT 法测定细胞活度  87
      3. 流式细胞技术检测凋亡细胞  87-88
      4. 流式细胞技术检测细胞周期  88
      5. RT-PCR  88-92
      6. 体内药效评价  92-94
      7. 统计学分析  94-95
  结果  95-115
  讨论  115-117
  结论  117-118
  参考文献  118-121
附录  121-123
论著  123-139
综述  139-150
  参考文献  147-150
附表  150-155
致谢  155-156

IL-12的抗辐射作用及相关机制研究

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