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FTY720诱导人结肠癌细胞凋亡、增强化疗药物敏感性的作用及其机制研究

作　者: 邢颖
导　师: 韩英
学　校:
专　业: 消化内科学
关键词: FTY720 结肠癌凋亡多药耐药
分类号: R735.35
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：FTY720,由中药冬虫夏草有效成分ISP-1改造而成,最初作为一种新型的免疫抑制剂广泛应用于临床。近来研究发现,FTY720还能抑制多种肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。然而,FTY720有关结肠癌方面的报道十分罕见且存在分歧。因此,本研究旨在探讨FTY720对人结肠癌细胞系HCT-8及其多药耐药细胞系HCT-8/5-Fu的抑制增殖、诱导凋亡、以及增强化疗药物毒性作用及其相关机制。方法：①MTT比色法测定FTY720单独、联合5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)、顺铂、阿霉素、依托泊苷对HCT-8、HCT-8/5-Fu细胞活性、药物敏感性的影响；②流式细胞仪Annexin-V/PI双染技术,测定FTY720单独、联合化疗药物作用结肠癌细胞系24小时后对细胞凋亡的影响；③Western blot法检测用药前后细胞内核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)磷酸化和非磷酸化p65亚基蛋白水平的变化,实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, QRT-PCR)法检测细胞内xIAP、cIAP-2等基因表达的变化；④采用流式细胞术和QRT-PCR法检测单独或联合应用FTY720对细胞内P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和多药耐药蛋白-1(multidrug resistance protein1, MRP1)的功能、mRNA水平的影响,以及百日咳毒素(pertussis toxin, PTx)能否在上述过程中发挥保护作用。结果：①MTT结果显示单独应用FTY720后,HCT-8及其多药耐药株HCT-8/5-Fu细胞的增殖受到明显抑制,并呈时间、浓度依赖关系,24小时的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)分别为12.99±0.54μM、13.67±0.45；②流式细胞术提示FTY720可以明显促进结肠癌细胞的凋亡,且具有时间、浓度依赖性;③10μM FTY720联合化疗药物处理结肠癌细胞,可明显减小药物的IC50值(5-Fu:HCT-84.79±0.64μg/ml VS.198.67±12.32ug/ml, HCT-8/5-Fu228.36±16.58μg/ml VS.1479.28±35.26μg/ml;CP:HCT-80.59±0.07μg/ml VS.5.64±0.93μg/ml, HCT-8/5-Fu1.23±0:23μg/ml VS.24.64±3.65μg/ml; DOX:HCT-80.24±0.07μg/ml VS.1.70±0.25μg/ml, HCT-8/5-Fu2.15±0.54μg/ml VS.14.00±0.11μg/ml;VP16:HCT-80.67±0.01μg/ml VS.5.13±0.43μg/ml, HCT-8/5-Fu4.67±0.05μg/ml VS.36.51±0.07μg/ml),增强药物敏感性,增加凋亡；④单独应用FTY720能显著降低细胞核内NF-κB磷酸化p65亚基水平以及其下游基因(xIAP、cIAP-2、cFLIPL、cFLIPS和Bcl-xL)mRNA的表达水平；⑤FTY720单独或联合化疗药物作用结肠癌细胞,均能抑制P-gp和MRP1的功能和mRNA表达,显著增加细胞内荧光物质蓄积和潴留,但不呈明显的时间依赖性,百日咳毒素的应用不能逆转其对P-gp和MRP1的抑制。结论：本实验首次系统性地研究FTY720对结肠癌细胞系HCT-8及其多药耐药株HCT-8/5-Fu的影响,发现FTY720呈浓度、时间依赖性地抑制细胞增殖、促进凋亡；还能增强细胞对常用结肠癌化疗药物5-氟脲嘧啶、顺铂、依托泊苷和阿霉素的敏感性,逆转耐药。此外,本实验还首次提示FTY720可以通过抑制P-gp、MRP1的功能和表达,从而诱导凋亡、逆转耐药,且PTx不能逆转其抑制作用。

FTY720诱导人结肠癌细胞凋亡、增强化疗药物敏感性的作用及其机制研究

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