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酒精诱导PC12细胞凋亡作用与神经鞘磷脂循环的关系

作　者: 于喆
导　师: 刘彬
学　校: 河南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: PC12细胞 细胞凋亡 酒精 神经鞘磷脂循环 神经酰胺
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 23次
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内容摘要


目的建立酒精诱导的PC12细胞凋亡模型，观察酒精对PC12细胞神经鞘磷脂循环相关酶活性及其mRNA的表达量的影响，分析神经鞘磷脂循环在神经细胞凋亡中的作用，为进一步研究神经细胞凋亡机制打下基础。方法MTT法测定酒精对PC12细胞增殖的抑制作用；用PI/Hoechst33342染色观察细胞核形态学变化；DNA琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA断裂； RT-PCR法检测酒精对PC12细胞SMS1、SMS2和N-SMase mRNA表达的影响；薄层层析方法测定SMS的活性；荧光分光光度法检测N-SMase的活性；采用高内涵活细胞成像系统检测线粒体膜电位变化；Western-blotting检测酒精致PC12细胞凋亡过程中，凋亡关键蛋白Caspase-3、 Caspase-9表达量变化。结果MTT法结果显示，用100mmoL/L、200mmoL/L、300mmoL/L、400mmoL/L和800mmoL/L浓度的酒精处理去血清培养PC12细胞24h，细胞存活率分别是单纯去血清培养PC12细胞的85.66%、74.28%、62.47%、54.14%和50.35%，呈浓度依赖性，与对照组比较差异显著(P<0·05)。用PI/Hoechst33342染色法观察细胞核形态学变化，有典型凋亡现象出现，凋亡率增加。用酒精浓度为100mmoL/L、200mmoL/L、300mmoL/L和400mmoL/L处理去血清培养PC12细胞24h，DNA琼脂糖凝胶电泳观察100mmoL/L、200mmoL/L、300mmoL/L和400mmoL/L浓度酒精处理组呈现凋亡细胞典型梯状DNA。RT-PCR方法检测酒精对PC12细胞SMS和N-SMase mRNA表达的影响，结果显示，不同浓度的酒精作用0.5h，SMS1在PC12细胞中的表达量没有明显的变化，当反应时间超过1h后，SMS1表达水平显著增加；SMS2的mRNA表达量在8h时下降。不同浓度的酒精作用于PC12细胞1h内，N-SMase活性无明显变化，当作用时间达到2h，N-SMase活性明显提高。不同浓度酒精处理PC12细胞2h，细胞内总SMS活性增高。不同浓度酒精处理PC12细胞24h， PC12细胞线粒体膜电位下降并呈浓度依赖性。不同浓度酒精处理PC12细胞24h，凋亡关键蛋白Caspase-3、Caspase-9表达量升高。结论酒精能诱导PC12细胞凋亡，诱导作用随浓度升高而增强。酒精诱导PC12细胞凋亡与神经鞘磷脂循环有关。酒精作用于PC12细胞使SMS1和N-SMase mRNA表达量增高，酶活性增强，SMS2mRNA表达量下降。酒精诱导PC12细胞凋亡与线粒体途径有关。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
前言  10-12
1 材料、试剂和仪器  12-16
  1.1 细胞株  12
  1.2 主要试剂  12-13
  1.3 主要试剂配制  13-14
  1.4 仪器  14-16
2 实验方法  16-24
  2.1 MTT 法检测细胞增殖率  16
  2.2 Hoechst 33342/PI 染色观察细胞核型改变  16-17
  2.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳  17
  2.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）  17-20
    2.4.1 细胞总 RNA 提取  17-18
    2.4.2 细胞总 RNA 定量及电泳鉴定  18
    2.4.3 逆转录合成 cDNA 第一链  18
    2.4.4 PCR 反应  18-20
  2.5 薄层层析法测定 SMS 活性  20
  2.6 N-SMase 活性测定  20-21
    2.6.1 细胞总蛋白的提取  20
    2.6.2 细胞总蛋白定量  20-21
    2.6.3 N-SMase 活性测定  21
  2.7 高内涵活细胞成像系统测线粒体膜电位  21
  2.8 Western blotting 检测凋亡相关蛋白  21-23
    2.8.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  21-22
    2.8.2 转膜和封闭  22
    2.8.3 免疫印记  22-23
  2.9 统计学分析  23-24
3 结果  24-36
  3.1 酒精对 PC12 细胞增殖的抑制作用  24-25
  3.2 Hoechst 33342/PI 染色观察 PC1 2 细胞凋亡形态学变化  25
  3.3 DNA 电泳检测凋亡细胞 DNA 梯状条带  25-26
  3.4 酒精对 PC12 细胞 SMS1、SMS2 和 N-SMase mRNA 表达的影响  26-29
    3.4.1 酒精对 PC12 细胞 SMS1 mRNA 的表达影响  26-27
    3.4.2 酒精对 PC12 细胞 SMS2 mRNA 表达的影响  27-28
    3.4.3 酒精对 PC12 细胞 N-SMase mRNA 表达的影响  28-29
  3.5 酒精对于 PC12 细胞总 SMS 活性的影响  29-30
  3.6 PC12 细胞中 N-SMase 酶活性在酒精处理后的变化  30-31
  3.7 酒精对 PC12 细胞线粒体膜电位的影响  31-32
  3.8 酒精对 PC12 细胞 Caspase-3，Caspase-9 蛋白表达的影响  32-36
4 讨论  36-38
5 结论  38-40
参考文献  40-42
文献综述  42-58
  参考文献  52-58
附录  58-60
致谢  60-61

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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