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背景与目的：肺癌是全球范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。美国数据统计,在2009年美国大概有219440人患有肺癌,而将近159390人死于该疾病,而全球每年约有130万人死于肺部肿瘤。因肺癌大多发病隐匿,大部分患者确诊时已属晚期,失去手术机会。当前,恶性肿瘤的治疗主要采用手术治疗、放化疗等方法。随着分子生物学及药理学的发展,生物治疗、靶向治疗及多学科的综合治疗已成为抗肿瘤研究的热点。而且大量数据证实,抗肿瘤化疗药物毒副作用大,且长期用易产生耐药性等劣势。近年来中医中药抗肿瘤越来越受到国内外医药界的关注。诱导肿瘤细胞的凋亡视为治疗肿瘤疾病的主要目标和手段。扶正消癌合剂是导师多年经验用方,临床研究表明它能改善晚期肺癌患者的临床症状,增强机体免疫功能,提高生存质量等。但是具体作用机制还不明确。本实验采用血清药理学方法,研究扶正消癌合剂对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响并探讨可能存在的发生机制,为其临床应用提供可能的理论和实验依据。方法：雄性SD大鼠60只随机分为6组(每组10只,组间体重无差别),分别是扶正消癌合剂低剂量、中剂量和高剂量组,DDP组,中药联合DDP组,生理盐水组,中药组按照人与鼠体表面积换算法及血清药理学实验方法,分别给予扶正消癌合剂低、中、高剂量灌胃药液灌胃,DDP组给予腹腔注射0.5mg/ml的DDP,中药联合DDP组予扶正消癌合剂中剂量灌胃药液灌胃及腹腔注射0.5mg/ml的DDP,生理盐水组予0.9%氯化钠溶液灌胃。均连续给药7天,每天2次,每次2m1。末次灌胃后2h后水合氯醛腹腔注射麻醉,无菌条件下腹主动脉采血,分离血清,56℃灭活30min,经0.22μm过滤除菌,-20℃保存备用。制备大鼠含药血清,MTT法检测扶正消癌合剂含药血清对人肺腺癌A549细胞增值的影响。Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术观察含药血清对A549细胞凋亡的影响。Western-Blot检测含药血清对P53, Bcl-2及Survivin蛋白表达的影响。结果：1.倒置显微镜下观察,正常A549细胞呈贴壁生长,多为梭形或椭圆形,胞浆透亮饱满,细胞增殖速度快。扶正消癌合剂含药血清作用48h后,可见空白对照组细胞状态生长良好。而中剂量组部分细胞的形态变为圆形,细胞间隙些许增大,高剂量组和DDP组,细胞体积变小,细胞间隙较宽,少部分细胞出现脱落。观察到联合组的细胞出现脱落,部分细胞肿胀、破碎,呈坏死状态。并且药物作用72h后细胞数量明显减少,细胞凋亡更加显著。2.不同浓度的中药含药血清作用于人肺腺癌A549细胞24h、48h、72h,对细胞有明显的抑制功能。随着含药血清药物浓度的增加、时间的延长,抑制作用则增强,呈现时间及剂量相关性,并且高浓度组抑制率仅次于DDP组,联合组抑制率最高,高达38.68%,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。作用96h后,抑制率反而下降。可见药物作用最佳时间和药物浓度。3. Western blot检测结果,与空白对照组比较,随着药物浓度增加,bcl-2蛋白及Survivin蛋白水平逐渐降低(P＜0.05),而P53蛋白的表达水平则呈增加趋势(P＜0.05),并且高剂量组表达量高于DDP组。结论：1.扶正消癌合剂以时间、剂量依赖方式抑制A549细胞增殖,与DDP合用有协同增效作用。2.扶正消癌合剂可以诱导细胞的凋亡,且以早期凋亡为主。3.扶正消癌合剂可能通过抑制Bcl-2、Survivin蛋白表达,同时活化P53蛋白表达诱导A549细胞的凋亡。
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