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从G蛋白偶联受体119表达探讨清热降浊方调控GLP-1分泌的分子机制

作　者: 刘文科
导　师: 仝小林
学　校: 中国中医科学院
专　业: 中医内科学
关键词: 清热降浊方黄连素 IEC-6细胞增殖凋亡 GLP-1 cAMP GLP-1mRNA GPR119mRNA GLP-1蛋白表达 GPR119蛋白表达
分类号: R259
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

一、清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞株增殖和凋亡的影响及其对IEC-6细胞分泌GLP-1的调控作用目的：观察清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞增殖和凋亡的影响以及对IEC-6细胞释放GLP-1的影响,探讨清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞释放GLP-1的影响是否与GPR119激活有关。方法：采用MTT比色法计算清热降浊方及黄连素干预后的IEC-6细胞存活率,观察清热降浊方对IEC-6细胞增殖的影响；采用Annexin V-FITC和PI双标流式术检测清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞凋亡的影响。应用放射免疫法,检测细胞上清液中GLP-1、cAMP含量,观察清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞分泌GLP-1的影响及可能的作用途径。结果：利用MTT法检测后得到的OD值,计算IEC-6细胞存活率,清热降浊方干预24h后,与正常胎牛血清培养相比,低浓度中药复方组细胞存活率显著增加(P<0.01),其中2.5%浓度含药血清组细胞存活率最高(162.42%),故选用2.5%浓度含药血清作为工作浓度。利用WST-1法检测后得到的OD值,计算IEC-6细胞存活率,黄连素干预24h后,与正常胎牛血清培养相比,低浓度黄连素组细胞存活率显著增加,其中1μg/mL黄连素组细胞存活率最高(220.17%),故选用1μg/mL黄连素浓度作为工作浓度。通过流式细胞术检测细胞凋亡率的结果显示,清热降浊方及黄连素干预24h后,不同葡萄糖状态下细胞的凋亡率均明显下降。相比高糖(正常培养,加胎牛血清)组,高糖加含药血清组细胞凋亡率下降了7.92%,高糖加黄连素组细胞凋亡率下降了6.23%；相比低糖(加胎牛血清)组,低糖加含药血清组细胞凋亡率下降了10.92%,低糖加黄连素组细胞凋亡率下降了8.51%；相比超高糖(加胎牛血清)组,超高糖加黄连素组细胞凋亡率下降了9.3%。放免法检测结果显示,高糖加含药血清组GLP-1含量为2.167±0.167pmol/g,高糖加黄连素组为1.870±0.098pmol/g,均明显高于高糖加胎牛血清组的GLP-1含量1.687±0.196pmol/g (P<0.01);低糖加含药血清组GLP-1含量1.942±0.119pmol/g,低糖加黄连素组为1.565±0.020pmol/g,均明显高于低糖加胎牛血清组的GLP-1含量1.441±0.102pmol/g (P<0.01);超高糖加黄连素组GLP-1含量为2.286±0.105pmol/g,明显高于超高糖加胎牛血清组的GLP-1含量1.856±0.015(P<0.01)。高糖加含药血清组cAMP含量为1.820±0.128pmol/mg,高糖加黄连素组为1.683±0.063pmol/mg,均明显高于高糖加胎牛血清组的cAMP含量1.539±0.065pmol/mg (P<0.01)；低糖加含药血清组cAMP含量1.457±0.057pmol/mg,低糖加黄连素组为1.428±0.053pmol/mg,均明显高于低糖加胎牛血清组的cAMP含量1.249±0.046pmol/mg (P<0.01)；超高糖加黄连素组cAMP含量为1.799±0.045pmol/g,明显高于超高糖加胎牛血清组的GLP-1含量1.655±0.069(P<0.01)。结论：清热降浊方能够促进IEC-6细胞增殖,减少细胞凋亡；促进IEC-6细胞分泌GLP-1,且其促GLP-1分泌作用,与GPR119-cAMP-GLP-1通路激活有关。黄连素在促进IEC-6细胞增殖、减少凋亡,促进GLP-1分泌方面的作用与清热降浊方一致。二、清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞GLP-1和GPR119蛋白及基因表达的影响目的：从基因、蛋白水平探讨清热降浊方及黄连素促进IEC-6细胞分泌GLP-1作用是否与促进GPR119表达有关。方法：应用RT-PCR技术检测IEC-6细胞表面GLP-1和GPR119mRNA的表达,根据检测的Ct值结果,计算GLP-1和GPR119mRNA相对表达量；应用Western blot技术检测IEC-6细胞表面GLP-1和GPR119蛋白表达,通过计算相对灰度值,计算GLP-1和GPR119蛋白相对含量。结果：RT-PCR法检测GLP-1和GPR119mRNA表达,以正常培养(10%胎牛血清)组为基准样品,计算2-ΔΔCt值,比较相对表达量。高糖加复方含药血清组GLP-1mRNA相对表达量为4.90359±0.273842,高糖加黄连素组GLP-1mRNA相对表达量为4.75654±0.244486,超高糖加黄连素组GLP-1mRNA相对表达量为4.95339±0.216146,超高糖加胎牛血清组GLP-1mRNA相对表达量为4.47110±0.199938,低糖加复方含药血清组GLP-1mRNA相对表达量为1.04591±0.163524,低糖加黄连素组GLP-1mRNA相对表达量为0.94792±0.085629,低糖加胎牛血清组GLP-1mRNA相对表达量为0.54016±0.041613。高糖加复方含药血清组GPR119mRNA相对表达量为5.00823±0.294559,高糖加黄连素组GPR119mRNA相对表达量为4.75283±0.307996,超高糖加黄连素组GPR119mRNA相对表达量为4.91934±0.284853,超高糖加胎牛血清组GPR119mRNA相对表达量为4.35557±0.237960,低糖加复方含药血清组GPR119mRNA相对表达量为1.00210±0.107958,低糖加黄连素组GPR119mRNA相对表达量为0.95795±0.075175,低糖加胎牛血清组GPR119mRNA相对表达量为0.44108±0.034275。高糖加复方含药血清组、高糖加黄连素组GLP-1mRNA及GPR119mRNA相对表达量显著高于正常高糖培养组(P<0.01)；低糖加复方含药血清组、低糖加黄连素组GLP-1mRNA及GPR119mRNA相对表达量显著高于低糖加胎牛血清组(P<0.01)；超高糖加黄连素组GLP-1mRNA和GPR119mRNA相对表达量显著高于超高糖加胎牛血清组(P<0.01)。Western blot法检测GLP-1和GPR119蛋白表达,计算目的蛋白与β-actin灰度值之比,结果为,高糖加复方含药血清组GLP-1蛋白相对含量为1.66333±0.074976,高糖加黄连素组GLP-1蛋白相对含量为1.26583±0.025262,高糖加胎牛血清组GLP-1蛋白相对含量为0.90643±0.025290,低糖加复方含药血清组GLP-1蛋白相对含量为0.80650±0.024825,低糖加黄连素组GLP-1蛋白相对含量为0.79833±0.025201,低糖加胎牛血清组GLP-1蛋白相对含量为0.49217±0.043582,超高糖加黄连素组GLP-1蛋白相对含量为1.63833±0.052504,超高糖加胎牛血清组GLP-1蛋白相对含量为1.24667±0.035387。高糖加复方含药血清组GPR119蛋白相对含量为1.59017±0.056912,高糖加黄连素组GPR119蛋白相对含量为1.37133±0.035478,高糖加胎牛血清组GPR119蛋白相对含量为0.77183±0.025725,低糖加复方含药血清组GPR119蛋白相对含量为0.67033±0.040820,低糖加黄连素组GPR119蛋白相对含量为0.66643±0.022541,低糖加胎牛血清组GPR119蛋白相对含量为0.45283±0.024879,超高糖加黄连素组GPR119蛋白相对含量为1.60883±0.057881,超高糖加胎牛血清组GPR119蛋白相对含量为0.98058±0.062956。高糖加复方含药血清组、高糖加黄连素组GLP和GPR119蛋白相对含量显著高于正常高糖培养(高糖加胎牛血清)组(P<0.01)；低糖加复方含药血清组、低糖加黄连素组GLP和GPR119蛋白相对含量显著高于低糖加胎牛血清组(P<0.01)；超高糖加黄连素组GLP和GPR119蛋白相对含量显著高于超高糖加胎牛血清组(P<0.01)。结论：清热降浊方和黄连素能够促进IEC-6细胞表面GLP-1的表达,其促进表达的机制与清热降浊方及黄连素对细胞表面GPR119表达的上调作用有关。

全文目录

中文摘要  7-11
Abstract  11-16
英文缩略词索引  16-17
引言  17-19
第一部分文献综述  19-43
  综述一胰高血糖素样肽-1及其G蛋白偶联受体119的研究进展  19-35
    1. 2 型糖尿病的治疗现状及困惑  19-20
    2. GLP-1的生理学作用  20
    3. GLP-1在临床中的应用及研究进展  20-22
      3.1 GLP-1类似物  20-21
      3.2 DPP-Ⅳ抑制剂  21-22
    4. GPR119的生物学特点  22-23
      4.1 促进GLP-1分泌  22
      4.2 促进肠抑胃肽GIP分泌  22-23
      4.3 促进胰岛素分泌  23
    5. GPR119激动剂的研究进展  23-27
      5.1 GPR119内源性激动剂  23-25
      5.2 GPR119外源性激动剂  25-27
    结语  27-28
    参考文献  28-35
  综述二中药对胰高血糖素样肽-1促分泌作用的研究进展  35-43
    1. 单味药及其提取物的研究  35-38
      1.1 人参皂苷Re  35
      1.2 大黄素  35-36
      1.3 刺五加皂苷  36-37
      1.4 黄连素  37
      1.5 金钗石斛总生物碱  37-38
      1.6 水蛭、密蒙花  38
    2. 中药复方  38-40
      2.1 健脾清化方  38
      2.2 健胰方  38-39
      2.3 黄连解毒汤  39
      2.4 石斛合剂  39
      2.5 消渴方剂  39-40
    问题及展望  40-41
    参考文献  41-43
第二部分实验正文  43-103
  一、清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞株增殖和凋亡的影响及其对IEC-6细胞分泌GLP-1的调控作用  43-71
    前言  43-45
    材料与方法  45-55
      1. 实验材料  45-48
        1.1 实验细胞株  45
        1.2 主要仪器和设备  45
        1.3 主要实验试剂  45-46
        1.4 溶液配制  46-48
      2. 实验分组  48-49
      3. 实验方法  49-53
        3.1 IEC-6细胞的培养  49-50
        3.2 MTT法检测细胞生长周期  50
        3.3 MTT法检测细胞药物敏感性  50-51
        3.4 WST-1法检测细胞药物敏感性  51
        3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡  51-52
        3.6 放射免疫法测定IEC-6细胞上清液中GLP-1、cAMP含量  52-53
      4. 统计学处理  53-55
    结果  55-67
    讨论  67-69
    小结  69-71
  二、清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞GLP-1和GPR119蛋白及基因表达的影响  71-100
    前言  71-73
    材料与方法  73-81
      1. 实验材料  73-75
        1.1 细胞系  73
        1.2 主要仪器和设备  73
        1.3 主要实验试剂  73-74
        1.4 溶液配制  74-75
      2. 实验分组  75
      3. 实验方法  75-80
        3.1 IEC-6细胞的培养  75
        3.2 Real time PCR法检测细胞表面GPR119、GLP-1mRNA表达  75-77
        3.3 Western blot检测GLP-1、GPR119蛋白表达  77-80
      4. 统计学处理  80-81
    结果  81-95
    讨论  95-99
    小结  99-100
  参考文献  100-103
结论  103-105
致谢  105-106
附录  106-110

从G蛋白偶联受体119表达探讨清热降浊方调控GLP-1分泌的分子机制

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