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化脓隐秘杆菌溶血素蛋白诱导小鼠巨噬细胞凋亡的研究

作　者: 孟祥莉
导　师: 王君伟
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 化脓隐秘杆菌 溶血素 细胞凋亡 RAW264.7
分类号: S855.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)是革兰氏阳性短棒状杆菌，是牛、羊和猪等重要经济动物的条件性致病菌，常寄生于上呼吸道和消化道的黏膜处，可引起多种器官和黏膜的化脓性感染，给养殖业造成较大的经济损失。Pyolysin(PLO)是化脓隐秘杆菌分泌的一种外毒素，是化脓隐秘杆菌的一种重要毒力因子，具有溶细胞等生物学活性。但是溶血素在化脓隐秘杆菌感染宿主的过程中的毒力机制，目前尚不十分清楚。本研究克隆了编码化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的plo基因，进行原核表达PLO，检测表达蛋白的溶血活性，发现表达的重组PLO蛋白具有明显的溶血活性，并利用重组蛋白制备了多克隆抗体，所制备的多抗能够有效的阻断溶血素的溶血活性。将重组PLO蛋白作用小鼠腹膜巨噬细胞RAW264.7，光学显微镜与电子显微镜观察表明重组PLO能够诱导RAW264.7细胞发生明显的细胞凋亡现象，如凋亡小体的出现、核固缩、染色质聚集等；DNALadder检测结果显示，染色体DNA在琼脂糖凝胶电泳后出现典型的“梯形”条带；Annexin V法检测细胞凋亡率，流式细胞仪分析结果显示：0.5μg/mL溶血素处理RAW264.7细胞48小时后细胞凋亡率达到50.1%；MTT法检测PLO对RAW264.7细胞的增殖抑制作用，结果显示：一定浓度下溶血素蛋白对小鼠RAW264.7有明显的增殖抑制作用，呈剂量和时间依赖性；试剂盒检测caspase3的活性，发现caspase3活性均比对照组升高；并检测重组PLO蛋白对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等细胞因子的影响，结果显示：RAW264.7细胞负载溶血素后TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10细胞因子分泌量有不同程度的提高。这表明溶血素蛋白能够诱导巨噬细胞发生凋亡，并产生一系列细胞因子。综上所述，本研究原核表达了化脓隐秘杆菌溶血素蛋白，鉴定其生物学功能并将其作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7，研究溶血素诱导小鼠巨噬细胞凋亡，为溶血素的毒力机制和化脓隐秘杆菌致病机制研究提供了基础与依据。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-10
1 前言  10-19
  1.1 化脓隐秘杆菌感染的概况  10-11
  1.2 化脓隐秘杆菌病原学概述  11
  1.3 化脓隐秘杆菌的主要毒力因子  11-14
    1.3.1 溶血素 pyolysin  11-12
    1.3.2 神经氨酸酶 Neuraminidases  12
    1.3.3 胶原结合蛋白 Collagen-Binding Protein  12-13
    1.3.4 菌毛合成蛋白 Fimbriae  13
    1.3.5 其他毒力因子  13-14
  1.4 胆固醇依赖性的溶细胞素  14-15
    1.4.1 CDCs  14
    1.4.2 PLO 与 CDCs  14-15
  1.5 巨噬细胞  15-18
    1.5.1 巨噬细胞与免疫  15
    1.5.2 巨噬细胞的生物学功能  15-16
    1.5.3 巨噬细胞源性的细胞因子  16-17
    1.5.4 细胞凋亡及其途径  17
    1.5.5 细胞凋亡的检测方法  17-18
  1.6 研究的目的和意义  18-19
2 材料与方法  19-29
  2.1 材料  19-22
    2.1.1 试验动物、细胞  19
    2.1.2 菌种与质粒  19
    2.1.3 引物设计与合成  19
    2.1.4 主要试剂及抗体  19-20
    2.1.5 主要溶液的配制  20-21
    2.1.6 主要仪器  21-22
  2.2 化脓隐秘杆菌溶血素基因的克隆与表达  22-29
    2.2.1 plo 的克隆与表达  22-24
    2.2.2 兔抗 His-PLO 多克隆抗体的制备与反应性分析  24-25
    2.2.3 表达蛋白的溶血活性及其多抗的抗溶血活性  25-26
    2.2.4 溶血素诱导小鼠巨噬细胞 RAW264.7 凋亡的检测  26-28
    2.2.5 溶血素诱导小鼠巨噬细胞 RAW264.7 分泌细胞因子检测  28-29
3 结果与分析  29-42
  3.1 化脓隐秘杆菌溶血素基因的克隆与表达  29-32
    3.1.1 plo 基因的克隆  29
    3.1.2 重组表达载体的构建  29-30
    3.1.3 溶血素蛋白的原核表达  30-31
    3.1.4 重组溶血素蛋白的 Western blot 鉴定  31
    3.1.5 溶血素蛋白的纯化  31-32
  3.2 兔抗 His-PLO 多克隆抗体的制备与反应性分析  32-33
    3.2.1 Western blot 分析  32-33
    3.2.2 琼脂双扩散试验分析  33
    3.2.3 兔抗 His-PLO 蛋白多克隆抗体效价测定  33
  3.3 溶血试验  33-35
    3.3.1 重组蛋白 His-PLO 的溶血试验  33-34
    3.3.2 多抗中和 His-PLO 的抗溶血活性  34-35
  3.4 溶血素诱导小鼠巨噬细胞 RAW264.7 凋亡的影响  35-42
    3.4.1 His-PLO 对小鼠巨噬细胞损伤的形态观察  35-36
    3.4.2 His-PLO 蛋白抑制 RAW264.7 细胞生长  36-37
    3.4.3 DNA Ladder 分析  37-38
    3.4.4 流式细胞仪检测 RAW264.7 细胞凋亡率  38
    3.4.5 caspase 3 的活性检测  38-39
    3.4.6 细胞因子检测结果  39-42
4 讨论  42-44
  4.1 溶血素蛋白的原核表达  42
  4.2 溶血素蛋白试验剂量的选择  42
  4.3 溶血素与炎症反应  42-43
  4.4 溶血素与细胞凋亡  43
  4.5 溶血素、炎症反应、细胞凋亡与感染免疫  43-44
5 结论  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-50
攻读硕士期间发表的论文  50

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病 > 杆菌病
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