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H9N2禽流感病毒核蛋白NP单克隆抗体的制备与鉴定

作　者: 范钊
导　师: 葛铭
学　校: 东北农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 禽流感病毒单克隆抗体 NP蛋白
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一种急性病毒性传染病，根据致病情况的不同可分为非致病性禽流感、低致病性禽流感和高致病性禽流感三种类型。其中低致病性禽流感H9N2亚型最早出现于上世纪60年代，自90年代末期鸡的H9N2禽流感病毒在世界各地开始大面积出现。通过对禽流感进行的血清学调查发现H9N2阳性鸡群在禽流感阳性鸡群中所占比例超过90%，证明此亚型是影响我国养禽业的主要AIV亚型。本研究通过制备抗H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体，旨在为禽流感疫情监测及诊断方法的建立提供技术基础。将H9N2禽流感病毒经尿囊腔接种9-11日龄的SPF鸡胚，37℃环境孵育。用蔗糖密度梯度离心法将收集的病毒尿囊液离心，沉淀用PBS溶解并于-70℃保存。将纯化好的病毒与等量的弗氏完全佐剂混合后乳化用于首次免疫，每只小鼠100μg。14d后使用经弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行第二次免疫，每只小鼠100μg。再次间隔14d后以与第二次免疫相同的剂量和方式进行第三次免疫，细胞融合前进行一次加强免疫。三次免疫之后选取抗体效价最高的小鼠，取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合。融合后第7d用HAT培养液半量换液1次，第10d开始检测。将纯化好的H9N2禽流感病毒抗原、小鼠阴性血清分别进行倍比稀释，选择OD450值在1.0左右，且P/N值最大的抗原作为其最佳工作浓度。取8-11周龄的BALB/c小鼠注射灭菌液体石蜡，每只0.5mL。8d后将5×106个杂交瘤细胞从腹腔打入。采集腹水并离心以去除油脂沉淀。收集好的上清液用建立的ELISA方法检测腹水效价，保存于-70℃备用。将MDCK细胞铺至6孔细胞培养板做间接免疫荧光实验，凡有明亮绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。为了进一步鉴定2株杂交瘤细胞是否为抗H9N2禽流感病毒NP蛋白单抗，将重组真核表达质粒pCDNA-NP转染于MDCK细胞。阴性对照则使用经空质粒转染的细胞，转染24h后固定细胞进行IFA检测，在荧光显微镜下观察结果。凡有明亮绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。经过免疫与融合后使用有限稀释法对细胞株进行连续3次的亚克隆，共获得2株稳定分泌抗H9N2AIV抗体的杂交瘤细胞株，将其分别命名为1E7和3D6。将杂交瘤细胞的培养上清和腹水分别进行2倍系列稀释，结果1E7的腹水效价为1:25600，细胞上清效价为1:512。3D6的腹水效价为1:12800，细胞上清效价为1:256。用H9N2病毒感染MDCK细胞做IFA检测，结果显示2株杂交瘤细胞均可产生明亮绿色荧光，表明这2株杂交瘤细胞均可以与H9N2AIV的某些蛋白发生结合。使用经pCDNA-NP真核质粒转染的MDCK细胞做IFA检测，1E7和3D6出现了明亮绿色荧光。对照组未出现荧光。Western-Blot实验中2株单抗没有出现特异性条带。

全文目录

摘要  10-11
Abstract  11-13
1 引言  13-23
  1.1 禽流感病毒的概述  13
  1.2 禽流感病毒的病原学特征  13-15
    1.2.1 形态结构  13
    1.2.2 禽流感病毒的蛋白质  13-14
    1.2.3 禽流感病毒的理化特性  14-15
    1.2.4 禽流感病毒的培养特性  15
  1.3 禽流感病毒的生物学特性  15-16
    1.3.1 病毒的复制与成熟  15
    1.3.2 病毒的毒力差异  15-16
    1.3.3 禽流感病毒的变异  16
  1.4 禽流感的流行情况  16-19
    1.4.1 禽流感在宿主中的存在及传播方式  16-17
    1.4.2 高致病性禽流感的发生情况  17-18
    1.4.3 H9N2 禽流感病毒的流行情况  18
    1.4.4 禽流感未来的流行趋势  18-19
  1.5 H9N2 亚型禽流感防治的公共卫生学意义  19-20
  1.6 禽流感诊断方法的研究进展  20-22
    1.6.1 禽流感病毒的分离与鉴定  20
    1.6.2 血清学鉴定  20-21
    1.6.3 电镜技术  21
    1.6.4 免疫荧光技术  21
    1.6.5 分子生物学诊断技术  21
    1.6.6 胶体金技术  21-22
    1.6.7 单克隆抗体技术  22
  1.7 研究目的与意义  22-23
2 材料与方法  23-33
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 病毒、血清、细胞和质粒  23-24
    2.1.2 实验动物  24
    2.1.3 所用培养基及试剂  24-25
    2.1.4 主要仪器设备  25
  2.2 方法  25-33
    2.2.1 pCDNA-NP、PBD-HA 和 PBD-NA 重组质粒的构建  25
    2.2.2 pCDNA-NP、PBD-HA 和 PBD-NA 重组质粒的抽提  25-26
    2.2.3 抗原的制备  26
    2.2.4 ELISA 最佳抗原包被浓度的确定  26
    2.2.5 小鼠免疫  26-27
    2.2.6 小鼠骨髓瘤细胞的制备  27
    2.2.7 小鼠饲养细胞的制备  27
    2.2.8 小鼠免疫脾细胞的制备  27-28
    2.2.9 细胞融合  28-29
    2.2.10 间接 ELISA 检测方法的建立  29
    2.2.11 杂交瘤细胞的抗体检测  29
    2.2.12 阳性杂交瘤细胞的亚克隆筛选  29-30
    2.2.13 细胞的冻存与复苏  30
    2.2.14 小鼠腹水的制备  30-31
    2.2.15 单克隆抗体的特异性鉴定  31
    2.2.16 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定  31
    2.2.17 H9N2 AIV 8 个片段重组质粒的去内毒素提取  31
    2.2.18 H9N2 AIV 8 个片段重组质粒的转染  31-32
    2.2.19 单克隆抗体的间接免疫荧光试验  32
    2.2.20 Western-Blot 鉴定  32-33
3 结果  33-46
  3.1 pCDNA-NP、PBD-HA 和 PBD-NA 重组质粒的构建  33-34
  3.2 小鼠免疫的抗体效价  34-35
  3.3 抗原最佳包被浓度的确定  35
  3.4 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立  35-37
  3.5 杂交瘤细胞株的亚克隆检测  37-38
  3.6 杂交瘤细胞上清和腹水效价的测定结果  38-39
  3.7 单克隆抗体的特异性鉴定  39
  3.8 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性检测  39
  3.9 与 H9N2 AIV 反应的单克隆抗体间接免疫荧光检测  39-41
  3.10 与重组质粒反应的单克隆抗体间接免疫荧光检测  41-45
  3.11 单克隆抗体的 Western-Blot 鉴定  45-46
4 讨论  46-51
  4.1 NP 核蛋白单克隆抗体研制的重要意义  46
  4.2 抗原的纯化方式、免疫程序及剂量的确定依据  46-47
  4.3 DNA 免疫方式的特点  47
  4.4 DNA 免疫的机制与可行性  47-48
  4.5 单抗检测及鉴定方法的选择  48-49
  4.6 细胞污染及试剂使用对单抗制备的影响  49-51
5 结论  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-58
攻读硕士学位期间发表的学术论文  58

H9N2禽流感病毒核蛋白NP单克隆抗体的制备与鉴定

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