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HPS自转运蛋白的免疫原性及其与宿主细胞相互作用研究

作　者: 张玉娟
导　师: 陈焕春
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌自转运蛋白免疫原性单克隆抗体相互作用
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)作为猪上呼吸道的一种常在菌,在特定条件下可以侵入机体引起全身性疾病。近年来,该病给全球养猪业造成巨大经济损失,同时也引起了研究者的关注。目前,虽然有大量针对副猪嗜血杆菌的研究报道,寻找出许多毒力候选基因,但我们对副猪嗜血杆菌致病机制的了解还十分有限。革兰氏阴性细菌V型蛋白分泌系统,也称为自转运蛋白。该蛋白主要由3部分组成,包括信号肽,N端的passenger结构域(passenger domain)和C端的β结构域(βdomain),其中passenger结构域是其发挥功能的部分。研究表明,该蛋白与细菌的粘附、入侵、细胞毒性有关,可介导生物被膜的形成和血清抗性的产生,因此被认为是病原微生物的一种重要的毒力因子。为探究自转运蛋白在副猪嗜血杆菌的致病过程中可能起到的作用,本论文将副猪嗜血杆菌SH0165菌株中发现的两个自转运蛋白基因at2和at3作为研究对象,运用PCR、原核表达、单克隆抗体、蛋白免疫印迹等技术开展研究。主要研究结果如下：1. at2、at3、at2-passenger domain{at2-pd)和at3-passenger domain(at3-pd)的克隆及相应蛋白的原核表达以SH0165菌株的基因组DNA为模板,PCR扩增at2、at3、at2-pd和at3-pd,四个片段大小分别为2336bp、2443bp、1368bp和1392bp,分别编码771、780、450和458个氨基酸。将at2、at3分别与pET-30a连接,at2-pd、at3-pd分别与pET-28a连接,连接产物转化E.coli/DH5a菌株,将测序正确的质粒再转化E.coli/BL21(DE3)菌株并进行原核表达。结果成功克隆了上述4个片段并构建了其相应的原核表达载体,在E.coli/BL21(DE3)菌株中实现了上述4种蛋白的原核表达,分别命名为AT2、AT3、AT2-PD和AT3-PD。2. AT2-PD和AT3-PD蛋白的纯化及其单克隆抗体的制备在E.coli/BL21(DE3)菌株中表达的AT2-PD和AT3-PD蛋白以可溶性的形式存在,利用蛋白融合表达的组氨酸标签对蛋白进行纯化。使用纯化的蛋白免疫BALB/c鼠进行单克隆抗体的制备工作。结果AT2-PD蛋白获得5株能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E4、3C9、3D8、3E8和4B10；AT3-PD蛋白获得5株能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2E6、3H8、4C8、4F12和4H10。间接ELISA和Western-blot分析表明抗体特异性良好,其中4B10的效价为1：102400；4H10的效价为1：25600,这两份单克隆抗体用于后续实验的开展。3.AT2和AT3蛋白在E.coli/BL21(DE3)和SH0165上的定位分析利用获得的单克隆抗体结合Western-blot实验分析AT2和AT3蛋白分别在E.coli/BL21(DE3)-AT和SH0165上的定位情况。分别提取这两种细菌的细胞总蛋白,细胞膜总蛋白和分泌蛋白。结果显示,AT2和AT3蛋白分别存在于表达该蛋白的E.coli/BL21(DE3)菌株的细胞总蛋白,细胞膜总蛋白和分泌蛋白中；AT2蛋白存在于SH0165的细胞总蛋白和细胞膜总蛋白中；AT3蛋白存在于SH0165的细胞总蛋白、细胞膜总蛋白和分泌蛋白中。4.AT2和AT3蛋白的免疫原性分析由于AT2和AT3蛋白在SH0165是细胞膜蛋白和/或分泌蛋白,故对其免疫原性进行分析。首先检测其在15株HPS标准血清型菌株中的分布情况,实验表明at2基因除在标准血清型4型菌株中未扩增出相应条带外,其余均可扩增出相应条带；at3基因在所有标准血清型菌株中均可扩增出相应条带。利用纯化的AT2-PD和AT3-PD蛋白作为抗原包被酶标板,使用7份不同血清型菌株攻毒猪后获得的感染血清进行间接ELISA实验,结果显示为阳性；同时利用Western-blot对该7份血清中针对AT2-PD和AT3-PD的抗体也进行了检测,结果也显示为阳性。5.AT2和AT3蛋白分别与细胞相互作用使用分别表达AT2和AT3蛋白的E.coli/BL21(DE3)菌株分别与猪髋动脉内皮细胞、猪肺细胞、猪气管上皮原代细胞进行粘附与粘附阻遏实验,结果显示这两种细菌与上述3种细胞均无明显的粘附作用。分别使用纯化的AT2-PD和AT3-PD蛋白与上述3种细胞进行结合实验,通过间接免疫荧光观察,表明这两种蛋白均能分别结合到这3种细胞表面。综合以上研究内容的结果,我们认为这两个自转运蛋白属于分泌型蛋白,并具有良好的免疫原性。这两种蛋白能够结合多种体外培养的猪源细胞系。我们推测这两个蛋白具有作为亚单位疫苗和诊断抗原的潜在价值。这是首次对副猪嗜血杆菌中的单体自转运蛋白进行研究,确定了其定位情况并初步探究了其功能,但进一步的功能研究还有待后续实验的开展。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
缩略词  11-12
1 文献综述  12-16
  1.1 副猪嗜血杆菌研究  12-14
    1.1.1 副猪嗜血杆菌概述  12
    1.1.2 副猪嗜血杆菌致病机制研究进展  12-14
  1.2 革兰氏阴性细菌自转运蛋白  14-16
    1.2.1 自转运蛋白结构特征  14
    1.2.2 自转运蛋白的主要功能  14-16
    1.2.3 自转运蛋白的应用价值  16
2 研究目的与意义  16-17
3 材料与方法  17-32
  3.1 实验材料  17-21
    3.1.1 菌株、细胞、感染血清及质粒载体  17-18
    3.1.2 酶、试剂、试剂盒  18
    3.1.3 培养基及抗生素的配制  18-19
    3.1.4 主要溶液的配制  19-21
    3.1.5 实验动物  21
    3.1.6 主要仪器  21
    3.1.7 引物  21
  3.2 实验方法  21-32
    3.2.1 副猪嗜血杆菌的培养及基因组的提取  21-22
    3.2.2 基因克隆  22-25
    3.2.3 蛋白的原核表达、纯化及SDS-PAGE检测  25-26
    3.2.4 AT2-PD和AT3-PD蛋白单克隆抗体的制备  26-29
    3.2.5 细菌细胞膜总蛋白及分泌蛋白的提取  29
    3.2.6 Western blot分析  29
    3.2.7 细胞的培养  29-30
    3.2.8 细菌粘附实验  30-31
    3.2.9 间接免疫荧光实验  31-32
4 结果与分析  32-47
  4.1 基因克隆及蛋白的原核表达  32-35
    4.1.1 at2和at3基因及at2-pd和at3-pd的克隆与原核表达载体的构建  32-34
    4.1.2 AT2-PD和AT3-PD蛋白的纯化  34-35
  4.2 AT2-PD和AT3-PD蛋白的单抗隆抗体制备  35-37
    4.2.1 杂交瘤细胞的筛选及克隆  35-36
    4.2.2 Western-blot分析杂交瘤细胞上清  36
    4.2.3 间接ELISA测定单抗腹水效价  36-37
  4.3 AT2和AT3蛋白的细胞定位分析  37-41
    4.3.1 AT2和AT3蛋白在工程菌E.coli/BL21(DE3)上的定位  38-40
    4.3.2 AT2和AT3蛋白在HPS上的定位  40-41
  4.4 AT2和AT3蛋白的免疫原性分析  41-43
    4.4.1 at2和at3基因在HPS标准血清型菌株中的分布情况  41-42
    4.4.2 间接ELISA及Western-blot分析AT2和AT3蛋白的免疫原性  42-43
  4.5 蛋白与细胞相互作用结果  43-47
    4.5.1 E.coli/BL21(DE3)-AT2、E.coli/BL21(DE3)-AT3分别与PIEC、SJPL及猪气管上皮原代细胞的粘附与粘附阻遏实验  43-45
    4.5.2 AT2-PD和AT3-PD蛋白分别与PIEC、SJPL及猪气管上皮原代细胞的结合实验  45-47
5 讨论  47-50
  5.1 AT2和AT3蛋白的细菌定位情况及体外表达差异  47
  5.2 AT2和AT3蛋白具有良好的免疫原性  47-48
  5.3 AT2和AT3蛋白与宿主细胞的相互作用  48-49
  5.4 AT2和AT3蛋白的功能有待深入研究  49-50
6 结论  50-51
参考文献  51-56
致谢  56

HPS自转运蛋白的免疫原性及其与宿主细胞相互作用研究

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