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禽流感病毒H5N1 HA1与小鼠IgG Fc片段融合蛋白的表达研究
作 者: 洪素梅
导 师: 李自力;石德时
学 校: 华中农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: FcRn 禽流感病毒H5N1 HA1-Fc融合蛋白 表达
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
新生儿Fc受体(FcRn)是识别免疫球蛋白IgG Fc片段的特异性受体。大多数疾病的感染均发生在黏膜或由黏膜入侵机体。FcRn可特异性的结合IgG Fc片段,介导黏膜上皮细胞主动转运IgG,使机体获得抵御病原体的能力。因此可以将一个抗原和IgG的Fc片段融合,模拟IgG跨越黏膜表面的转移,就可以通过FcRn介导的IgG胞转通路转运抗原穿过黏膜屏障。禽流感病毒(Avian Infulenza Virus, AIV)主要通过呼吸道感染机体,本研究用禽流感病毒H5N1的主要保护性抗原血凝素HA1作为模式抗原,通过一个连接(Linker)片段(氨基酸序列:GSGGGGSGGGGSGS)与小鼠IgG2a Fc片段融合(HA1-Linker-wFc,简写为HA1-wFc),利用Bac-to-Bac表达系统表达HA1和IgG2aFc野生型片段的融合蛋白(HA1-wFc)及HA1和IgG2a Fc突变型片段的融合蛋白(HA1-mFc)。为今后进一步开展以FcRn介导的IgG胞转通路转运抗原的黏膜屏障的研究奠定良好的基础。本研究取得的主要结果如下:1. HA1-wFc基因的克隆根据GenBank上公布的禽流感病毒H5N1 HA1基因(AY830774.1)和小鼠IgG2a Fc基因(V00798.1)序列设计引物,利用实验室保存的质粒pMD18-T-HA1和pMD18-T-wFc为模板,分别扩增了禽流感病毒H5N1 HA1基因和小鼠IgG2a wFc片段基因,其中wFc片段C1q结合位点发生突变而丧失与其结合能力。用Linker把HA1与wFc片段相连(HA1-wFc),再与pMD18-T载体相连,对得到的阳性重组质粒pMD18-T-HA1-wFc进行序列测定,HA1基因和wFc基因(突变位点除外)与GenBank公布的相应基因序列同源性均为100%。2. HA1-mFc基因的克隆以重组质粒pMD18-T-HA1-wFc为模板,采用PCR定点突变方法对wFc与FcRn结合的关键位点进行突变,使其丧失与FcRn的结合能力。将HA1-mFc片段连接到pMD18-T载体,对得到的阳性重组质粒pMD18-T-HA1-mFc进行序列测定,HA1基因和mFc基因(突变位点除外)与GenBank公布的相应基因序列同源性均为100%。3.32a-HA1-wFc和KG-HA1融合蛋白的原核表达以重组质粒pMD18-T-HA1-wFc为模板,将HA1-wFc片段连接到载体pET-32a上构建重组原核表达质粒(pET-32a-HA1-wFc),并与实验室保存的pGEX-KG-HA1,分别在大肠杆菌中获得了表达,Western blot分析及红细胞凝集试验表明表达的32a-HA1-wFc和KG-HA1融合蛋白均具有良好的免疫学活性。4. HA1-wFc和HAl-mFc融合蛋白在杆状病毒系统中的表达分别以重组质粒pMD18-T-HA1-wFc和pMD18-T-HA1-mFc为模板,利用酶切连接方法分别将HA1-wFc和HA1-mFc基因片段连接到载体pFASTBAC HTb上构建重组真核表达质粒(pFASTBAC HTb-HA1-wFc和pFASTBAC HTb-HA1-mFc),并利用Bac-to-Bac系统成功获得了表达,Western blot分析及红细胞凝集试验表明表达的HA1-wFc和HA1-mFc融合蛋白均具有良好的免疫学活性。
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全文目录
摘要 7-9 ABSTRACT 9-11 缩略语表 11-13 1 文献综述 13-23 1.1 FcRn研究进展 13-18 1.1.1 FcRn的发现 13 1.1.2 FcRn的结构 13-14 1.1.3 IgG的结构 14-16 1.1.4 FcRn与IgG的相互作用 16-17 1.1.5 FcRn-IgG胞转作用(transcytosis) 17-18 1.1.6 FcRn在哺乳动物中的表达 18 1.2 禽流感研究进展 18-21 1.2.1 禽流感的危害 18-19 1.2.2 禽流感病毒的结构 19-20 1.2.3 禽流感的致病机制 20 1.2.4 禽流感疫苗的研究进展 20-21 1.3 重组杆状病毒表达载体简介 21-23 2 目的与意义 23-24 3 材料方法 24-48 3.1 材料 24-31 3.1.1 菌株及细胞 24 3.1.2 载体与质粒 24-26 3.1.3 主要药品与试剂 26 3.1.4 主要仪器 26 3.1.5 主要抗生素与培养基的配制 26-27 3.1.6 主要溶液配制 27-31 3.2 实验方法 31-48 3.2.1 引物设计 31-32 3.2.2 HA1、wFc基因的扩增 32 3.2.3 HA1-wFc基因的扩增 32-33 3.2.4 重组质粒pMD18-T-HA1-wFc的构建 33-35 3.2.5 HA1-mFc基因的扩增 35-37 3.2.6 重组质粒pMD18-T-HA1-mFc的构建 37 3.2.7 pET-32a-HA1-wFc原核表达载体的构建 37-38 3.2.8 重组原核表达质粒pET-32a-HA1-wFc和pGEX-KG-HA1的诱导表达及鉴定 38-40 3.2.9 原核表达融合蛋白的纯化 40-41 3.2.10 pFASTBAC HTb-HA1-wFc、pFASTBAC HTb-HA1-mFc真核表达载体的构建 41 3.2.11 pFASTBAC HTb-HA1-wFc、pFASTBAC HTb-HA1-mFc重组质粒的转座 41-42 3.2.12 杆粒Bacmid的提取与鉴定 42-44 3.2.13 重组阳性杆粒Bacmid转染Sf9细胞 44-45 3.2.14 重组阳性杆状病毒的扩增 45-46 3.2.15 重组HA1-wFc与HA1-mFc蛋白的表达与鉴定 46-48 4 实验结果 48-60 4.1 PCR扩增结果 48-50 4.1.1 HA1-Linker片段与Linker-Fc片段PCR扩增结果 48-49 4.1.2 HA1-wFc片段与HA1-mFc片段PCR扩增结果 49-50 4.2 克隆载体的构建和鉴定 50-52 4.3 表达载体的构建和鉴定 52-54 4.3.1 HA1-wFc原核表达载体的构建与鉴定 52 4.3.2 HA1-wFc真核表达载体的构建与鉴定 52-53 4.3.3 HA1-Linker-mFc真核表达载体的构建和鉴定 53-54 4.4 重组杆粒Bacmid的鉴定 54-55 4.4.1 目的引物鉴定 54 4.4.2 M13引物鉴定 54-55 4.5 阳性杆粒Bacmid转染Sf9细胞 55-56 4.6 融合蛋白表达与鉴定 56-60 4.6.1 KG-HA1蛋白的原核表达与鉴定 56 4.6.2 32a-HA1-wFc融合蛋白的原核表达与鉴定 56-57 4.6.3 HA1-wFc融合蛋白的真核表达与鉴定 57 4.6.4 HA1-mFc融合蛋白的真核表达与鉴定 57-60 5 讨论 60-62 5.1 引物设计 60 5.2 重组HA1-mFc融合蛋白的表达 60 5.3 阳性重组杆状病毒的扩增 60-62 6 结论 62-63 参考文献 63-69 致谢 69
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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