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副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体的研究

作　者: 张建
导　师: 杨靖亚
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 副溶血弧菌耐热溶血毒素检测单克隆抗体
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文提取与纯化副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH),对其相关性质进行了分析,通过杂交瘤技术成功制备出TDH的鼠性单克隆抗体,并对其性质进行了鉴定。本文利用副溶血弧菌胞外分泌耐热溶血毒素这一特性,在含有一定营养成分的细菌培养液增殖培养致病性副溶血弧菌,盐析提取粗蛋白,之后经过离子交换层析及凝胶多次层析方法对副溶血弧菌耐热溶血毒素进行了纯化,最终纯化得到了副溶血弧菌主要致病因子TDH。由于下面要利用TDH免疫动物,研究探索免疫学方法检测副溶血弧菌方法,接下来从变性温度、毒性、耐热性等几个理化相关性质进了分析和鉴定。结果表明,副溶血弧菌直接耐热溶血毒素是典型的蛋白质;此毒素具有较强的毒性效应,少量TDH静脉注射小鼠就能是小鼠在短时间内死亡;同时,本研究还利用了差示热量扫描法和加热处理方法对TDH的耐热性进行了分析,证明了此毒素具有较强的耐热性。实验中,我们将TDH作为免疫原免疫小鼠成功得到多克隆免疫血清,根据Western斑点印迹原理检测致病性副溶血弧菌,取得了良好的效果。探讨了特异性免疫血清的最佳工作浓度以及分别对致病性副溶血弧菌与非致病性副溶血弧菌的敏感性,结果表明此方法可针对性的检测分泌TDH的致病性副溶血弧菌,对非致病性副溶血弧菌不敏感,操作简单、灵敏度高、可用肉眼直接判定结果,为致病性副溶血弧菌的检测提供一种简单、快速、有效的方法。目前,单克隆抗体技术广泛应用在细菌检测领域,并取得良好的效果。本文利用提取纯化得到的TDH联合佐剂多次免疫小鼠,根据杂交瘤原理,依次通过动物免疫、细胞融合、单克隆抗体的筛选和克隆,最后对杂交瘤细胞的亲和性、抗体类型、特异性、稳定性等性质进行了研究,成功研制出抗TDH鼠性单克隆抗体,实验结果表明,本实验制作的TDH单克隆抗体特异性高、稳定性强、亲和力高。鉴于TDH和致病性副溶血弧菌感染的密切关系,利用TDH单克隆抗体初步探索应用在副溶血弧菌检测方面的前景。表明利用单克隆抗体为基础在致病性副溶血弧菌检测方面将具有巨大的应用前景,为开发胶体金技术检测副溶血弧菌奠定一定的基础。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章绪论  11-20
  1.1 课题的研究背景、意义及内容  11-14
    1.1.1 课题的研究背景  11-12
    1.1.2 课题的研究意义  12-13
    1.1.3 课题研究的主要内容  13-14
  1.2 国内和国际副溶血弧菌检测的研究现状  14-20
    1.2.1 免疫学检测副溶血弧菌的研究  14-15
    1.2.2 分型方法检测副溶血弧菌的研究  15-17
    1.2.3 PCR 方法检测副溶血弧菌  17-18
    1.2.4 核酸分子检测副溶血弧菌的研究  18-20
第二章一般材料与方法  20-23
  2.1 常用实验材料  20-21
    2.1.1 细菌株与细胞株  20
    2.1.2 常用试剂  20-21
  2.2 仪器与设备  21-22
  2.3 主要试剂的配制  22-23
第三章副溶血弧菌耐热溶血毒素的提取与纯化  23-31
  3.1 引言  23
  3.2 实验材料  23-24
    3.2.1 实验试剂  23
    3.2.2 细菌株及培养条件  23-24
    3.2.3 主要仪器设备  24
  3.3 实验方法  24-28
    3.3.1 耐热溶血毒素粗蛋白的提取与制作  24
    3.3.2 耐热溶血毒素的纯化  24-26
    3.3.3 TDH 蛋白质浓度的测定  26-27
    3.3.4 溶血活性分析  27-28
  3.4 结果  28-29
    3.4.1 TDH 的提取与纯化  28-29
    3.4.2 TDH 蛋白质浓度的测定  29
    3.4.3 TDH 溶血活性的分析  29
  3.5 讨论  29-30
  3.6 小结  30-31
第四章耐热溶血毒素相关性质的研究与鉴定  31-36
  4.1 引言  31
  4.2 实验材料  31-32
    4.2.1 实验药物和试剂  31
    4.2.2 实验动物  31
    4.2.3 主要仪器设备  31-32
  4.3 实验方法  32-33
    4.3.1 TDH 的变性温度的测量  32
    4.3.2 TDH 的毒性分析  32
    4.3.3 TDH 的耐热性测定  32-33
  4.4 结果  33-34
    4.4.1 TDH 变性温度的测定  33
    4.4.2 TDH 的毒性分析  33-34
    4.4.3 耐热性分析  34
  4.5 讨论  34-35
  4.6 小结  35-36
第五章 Western 斑点印迹法检测致病性副溶血弧菌  36-42
  5.1 引言  36
  5.2 实验材料  36-37
    5.2.1 实验动物和试剂  36-37
    5.2.2 细胞株及培养条件  37
    5.2.3 主要仪器设备  37
  5.3 实验方法  37-38
    5.3.1 特异性抗TDH 免疫血清的制备  37
    5.3.2 使用Western 斑点印迹法检测致病性副溶血弧菌操作程序  37-38
    5.3.3 抗体最佳工作浓度的确定  38
    5.3.4 TDH 免疫血清对致病性副溶血弧菌的特异性试验  38
  5.4 结果  38-40
    5.4.1 特异性抗TDH 免疫血清的制备  38-39
    5.4.2 抗体最佳工作浓度的确定  39
    5.4.3 对致病性副溶血弧菌与非致病性副溶血弧菌的敏感性  39-40
    5.4.4 重复性试验  40
  5.5 讨论  40-41
  5.6 小结  41-42
第六章副溶血弧菌TDH 鼠性单克隆抗体的制作和鉴定  42-62
  6.1 引言  42
  6.2 实验材料  42-43
    6.2.1 实验药物和试剂  42-43
    6.2.2 细胞株及动物  43
    6.2.3 主要仪器设备  43
  6.3 实验方法  43-50
    6.3.1 TDH 免疫动物方式与周期的建立  43-45
    6.3.2 饲养细胞的制作  45-46
    6.3.3 骨髓瘤细胞的准备  46-47
    6.3.4 脾细胞的制备  47
    6.3.5 细胞融合  47
    6.3.6 杂交瘤细胞的选择性培养  47-48
    6.3.7 杂交瘤细胞的筛选  48-49
    6.3.8 单克隆抗体的克隆化  49
    6.3.9 单克隆抗体的鉴定  49-50
  6.4 实验结果  50-60
    6.4.1 TDH 的动物免疫  50-51
    6.4.2 饲养细胞的制备  51
    6.4.3 骨髓瘤细胞的制备  51-52
    6.4.4 细胞融合  52-56
    6.4.5 单克隆抗体的筛选、检测及克隆化  56-57
    6.4.6 单克隆抗体的鉴定  57-60
  6.5 讨论  60-61
  6.6 小结  61-62
第七章结论  62-64
致谢  64-65
参考文献  65-67

副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体的研究

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