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我国11株H5N2亚型AIV的基因特征及对禽的致病性研究

作　者: 段振华
导　师: 张书霞；李雁冰
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 禽流感病毒 H5N2 遗传分析 致病性 传播 复制
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


自1983年,美国宾夕法尼亚州鸡体内首次出现H5N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)至今,H5N2亚型禽流感病毒已在世界范围内广泛流行,并引起不同程度的禽流感疫情。我国于2005-2006年在江西省鄱阳湖和黑龙江省扎龙湿地的正常野鸭体内分离到11株H5N2亚型禽流感病毒。为了解我国野生水禽携带的H5N2亚型禽流感病毒的生物学特性与致病性,本研究首先对这11株H5N2亚型禽流感病毒进行了全基因组序列测定、同源性比较及遗传演化分析；在此基础上就分离自不同地域的病毒代表株对家禽的感染和致病能力进行了评估。病毒的全基因组序列测定、同源性比较及遗传演化分析：利用Trizol Ls RNA提取试剂盒从各病毒株感染的鸡胚尿囊液中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增所有毒株各个基因片段的cDNA。产物经纯化后在CEQ8000基因测序仪上进行序列测定。用DNASTAR分析软件包进行序列的数据编辑、翻译、进化树的绘制和遗传演化分析。结果表明,11株H5N2亚型禽流感病毒同属于欧亚种系,并且可以划分为6个基因型。2005年分离自江西省的10株H5N2亚型禽流感病毒HA基因裂解位点均具有4～6个连续的碱性氨基酸,具有高致病性禽流感病毒HA蛋白裂解位点的基因特征。10株病毒的HA、NA、PA和NP基因核苷酸和氨基酸的同源率较高,在95%-100%和93.9%～98.4%之间；并且10株病毒的HA、NP和NS基因与引起我国2004-2005年南方家禽流感疫情的高致病性禽流感病毒代表株DK/JX/25/04(H5N1)的核苷酸最高同源率都在97.7%以上。2006年分离自黑龙江省的1株H5N2亚型禽流感病毒HA基因裂解位点为R-E-T-R,属于典型的H5亚型低致病力毒株；该毒株在核苷酸同源性上与江西省的10株病毒差异较大。遗传进化上,11株病毒的HA、NA、PB1、PA和NS基因进化关系较近,但分别以不同的毒株为祖先进化而来,PB2、NP和M基因在各自的进化关系上距离较远。另外,江西省的10株病毒在HA和PA基因进化关系上与2004-2005年我国南方家禽中流行的H5N1高致病性禽流感病毒较近,都以GS/GD/1/96(H5N1)为祖先进化而来。代表毒株对家禽的感染和致病能力评估：感染实验以106EID50的病毒量鼻腔感染SPF鸡和SPF鸭后,于第3、5天分别剖杀感染的实验动物3只,采集喉头拭子、泄殖腔拭子和各组织脏器,进行病毒含量滴定和病理组织学观察。致病力实验采用国际OIE IVPI方法,10倍稀释病毒感染的鸡胚尿囊液,0.2 mL/只静脉接种4周龄SPF鸡和SPF鸭各10只,观察10天。结果表明：分离自江西省的10株H5N2亚型禽流感病毒的代表株Mallard/JX/116/05对SPF鸡和SPF鸭的IVPI分别为3.0和2.42,均大于1.2,表现出很强的致病能力。而分离自黑龙江省Mallard/HLJ/134/06毒株对SPF鸡和SPF鸭均不表现任何临床症状。鼻腔感染SPF鸡和SPF鸭后,Mallard/JX/I16/05毒株对实验动物表现出很高的致死率,且表现出典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,胸腺出血、肿胀,肝脏肿大、呈淡土黄色,肺脏表面出血、充血,脾脏肿大出血。病理组织学检查发现大脑呈典型的病毒性脑炎病变,全身各器官以出血、充血、细胞变性坏死和淋巴细胞浸润为主要特征。喉头及泄殖腔拭子和各脏器均可分离到病毒。而Mallard/HLJ/134/06毒株对实验动物的致死率为0,且无临床症状,除了能在气管和法氏囊分离到少量的病毒外,其他器官均分离不到病毒。但攻毒后21天,感染和同居动物血清均能检测到抗体。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11第一篇 文献综述  11-28  第一章 禽流感及其致病机理研究进展  12-28    1. 禽流感的历史和现状  12-14      1.1 禽流感的历史  12-13      1.2 禽流感的现状  13-14        1.2.1 H5和H7高致病性禽流感  13-14        1.2.2 H5N2亚型禽流感  14    2 禽流感病毒的形态结构  14-16    3 禽流感病毒的抗原性变异  16-17    4 野生水禽与禽流感病毒  17-18    5 流感病毒致病性的分子基础  18-25      5.1 流感病毒各蛋白与致病性的关系  18-23        5.1.1 HA蛋白与致病性  18-19        5.1.2 NA蛋白与致病性  19-20        5.1.3 聚合酶复合体蛋白与致病性  20-21        5.1.4 NP蛋白与致病性  21-22        5.1.5 M蛋白与致病性  22        5.1.6 NS蛋白与致病性  22-23      5.2 流感病毒宿主特异性的分子基础  23-25        5.2.1 HA基因与宿主特异性的关系  23-24        5.2.2 NA基因与宿主特异性的关系  24-25        5.2.3 内部基因与宿主特异性的关系  25    6. 本研究的目的和意义  25-28第二篇 试验研究  28-62  第二章 H5N2亚型禽流感病毒的基因特征及遗传进化分析  30-50    1 材料与方法  31-35      1.1 材料  31-32        1.1.1 病毒  31        1.1.2 主要试剂与仪器  31-32        1.1.3 引物  32        1.1.4 参考序列  32      1.2 方法  32-35        1.2.1 病毒核酸的提取  32        1.2.2 cDNA的合成  32-33        1.2.3 聚合酶链式反应(PCR)  33        1.2.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物  33        1.2.5 PCR产物回收和纯化  33-34        1.2.6 PCR回收产物鉴定  34        1.2.7 全基因的序列测定  34-35        1.2.8 cDNA核苷酸、推导的氨基酸序列比较及系统进化树绘制  35    2 结果  35-47      2.1 PCR产物鉴定结果  35-36      2.2 序列分析  36-47        2.2.1 HA基因分析  36-39        2.2.2 NA基因分析  39-40        2.2.3 PB2基因分析  40-41        2.2.4 PB1基因分析  41-42        2.2.5 PA基因分析  42-43        2.2.6 NP基因分析  43-44        2.2.7 M基因分析  44-45        2.2.8 NS基因分析  45-46        2.2.9 H5N2亚型AIV基因型的划分  46-47    3. 讨论  47-50  第三章 H5N2亚型禽流感病毒对家禽的感染与致病性研究  50-62    1 材料与方法  51-52      1.1 材料  51        1.1.1 病毒  51        1.1.2 实验动物  51        1.1.3 试剂及主要仪器  51      1.2 方法  51-52        1.2.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))测定  51        1.2.2 静脉接种指数(IVPI)测定  51-52        1.2.3 SPF鸡和SPF鸭的感染试验  52    2 结果  52-58      2.1 两株病毒EID50的测定结果  52      2.2 IVPI的测定结果  52-53      2.3 两株H5N2亚型AIV对SPF鸡和SPF鸭感染试验结果  53-58        2.3.1 感染鸡试验结果  53-55        2.3.2 感染鸭试验结果  55-58    3 讨论  58-62      3.1 我国H5N2亚型AIV对家禽的致病力  58      3.2 我国H5N2亚型AIV对家禽的传播和复制  58-62参考文献  62-68全文总结  68-70致谢  70

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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