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基于杆状病毒表面展示技术的流感病毒NP疫苗研究

作　者: 张立霞
导　师: 许应天; 舒跃龙
学　校: 延边大学
专　业: 预防兽医学
关键词: NP蛋白 H5N1禽流感病毒 杆状病毒表面展示技术 免疫学评价
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


流感病毒的核蛋白(nucleoprotein, NP)高度保守,具有型特异性,能够诱导产生细胞介导的免疫应答,从而起到保护作用,抵抗不同亚型流感病毒的攻击。本研究主要利用杆状病毒表面展示技术,使用杆状病毒GP64蛋白的信号肽(signal peptide, SP)和胞质尾(cytoplasmic tail, CT),展示了甲型流感病毒(A/Hubei/1/2010H5H1)的NP蛋白,并对该NP蛋白的免疫原性和保护机制进行了探讨。利用RT-PCR技术,从A/Hubei/1/2010H5N1禽流感病毒中扩增获得NP基因,并通过重叠PCR技术,将NP基因与杆状病毒GP64的SP和CT串联,获得SP-NP-CT基因。将串联基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBac Dual,获得重组质粒pFastBac Dual-SP-NP-CT。接下来将重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞,经卡那霉素,庆大霉素和四环素三重抗生素筛选后,获得重组穿梭质粒SP-NP-CT-Bac。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒NP-Bac。纯化重组病毒NP-Bac,利用Western blot试验和免疫电镜试验对杆状病毒表面展示的NP蛋白进行检测及定位。定量NP蛋白,进行动物免疫实验和攻毒实验(攻击25ul10405TCID50/ml A/PR/8/34H1N1流感病毒),对该NP蛋白的免疫原性和保护性进行了评价。Western blot试验证明NP蛋白在Sf9昆虫细胞中获得了有效的表达。免疫电镜试验显示NP蛋白己成功展示在杆状病毒表面。ELISA结果证明NP疫苗可以诱导产生高水平的IgG抗体。ELISPOT结果筛选出4条肽(Pep7：NP49-66LSDYEGRLIQNSITIERM; Pep8:NP57-74IQNSITIERMVLSAFDER; Pep55:NP433-450TEGRTSDMRTEIIKMMES和Pep56:NP441-458RTEIIKMMESA-RPEDLSF),实际包括两个NP表位(NP57-66IQNSITIERM和NP441-450RTEIIKMMES)可以诱导小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ,同时证明NP蛋白也可以诱导产生IFN-Y。利用Pep8,Pep56和NP蛋白作为刺激原进行流式细胞试验,对抗原特异性T细胞进行了检测,结果证明Pep8,Pep56和NP均可刺激CD4+和CD8+诱导产生IFN-γ,主要以CD8+诱导为主,Pep56诱导能力最强。攻毒实验证明：该疫苗能够降低小鼠肺病毒载量(P<0.001),减轻肺组织损伤,降低体重下降率,具有50%的交叉保护作用。本研究利用杆状病毒表面展示技术展示的NP蛋白,不仅可以诱导产生体液免疫反应,还可以产生细胞介导的免疫反应,能够通过降低病毒载量起到交叉保护作用,抵抗不同亚型流感病毒的攻击。

全文目录


英汉縮略语名词对照  8-9
摘要  9-10
Abstract  10-11
前言  11-14
  1 基于NP通用型流感疫苗研究进展  11-12
  2 杆状病毒表面展示技术  12-13
  3 本研究的目的和意义  13-14
1 材料  14-17
  1.1 病毒,细胞和质粒  14
  1.2 实验动物  14
  1.3 主要试剂  14-15
  1.4 仪器  15
  1.5 主要试剂配制  15-17
2 方法  17-30
  2.1 引物的设计和合成  17
  2.2 目的基因的RT-PCR扩增  17-20
  2.3 重组质粒pFastBac Dual-SP-NP-CT的构建及鉴定  20-21
  2.4 重组质粒SP-NP-CT-Bac的构建及鉴定  21-22
  2.5 转染Sf9昆虫细胞  22-23
  2.6 Western blot检测  23
  2.7 病毒的扩大培养及纯化  23-24
  2.8 病毒负染及免疫电镜试验  24
  2.9 蛋白定量  24-25
  2.10 动物免疫及攻毒实验  25
  2.11 脾淋巴细胞的分离和肺组织的处理  25-26
  2.12 ELISA检测NP特异性IgG抗体  26
  2.13 ELISPOT筛选NP肽库  26-27
  2.14 流式细胞技术检测抗原特异性T细胞  27-28
  2.15 TCID_(50)试验  28-29
  2.16 肺组织病理形态学观察  29-30
3 结果  30-41
  3.1 PCR扩增结果  30
  3.2 重组质粒的酶切及PCR鉴定结果  30-31
  3.3 测序结果  31-32
  3.4 Western blot检测结果  32-33
  3.5 透射电镜观察结果  33-34
  3.6 免疫小鼠血清中抗NP IgG抗体的检测结果  34-35
  3.7 ELISPOT对NP肽池的筛选结果  35-36
  3.8 流式细胞技术对抗原特异性T细胞检测结果  36-37
  3.9 TCID_(50)试验测定病毒载量结果  37-38
  3.10 小鼠肺组织病理变化结果  38-39
  3.11 攻毒后小鼠体重变化  39-40
  3.12 NP疫苗的免疫保护性评价结果  40-41
讨论  41-43
结论  43-44
参考文献  44-49
致谢  49-50
在研期间发表的论文  50

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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