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表达H5N1禽流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及免疫保护性研究

作　者: 王伟
导　师: 刘明
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: H5N1亚型禽流感病毒 腺病毒表达系统 HA基因 免疫效力
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


H5N1亚型高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI）是一种严重危害养禽业的高度传染性、致死性疾病。自1997年起，H5N1病毒在全世界范围内蔓延，并且突破种间屏障感染包括人类在内的多种哺乳动物。目前疫苗免疫仍然是预防禽流感大流行的最有效途径，现有的传统全病毒灭活苗，依赖鸡胚进行生产，耗时长，难以满足需求。因此，寻求一种能够迅速生产、廉价、高效的新型流感疫苗对于禽流感的防控具有重要的意义。腺病毒载体做为治疗基因的递送载体，具有宿主范围广、高效表达外源基因、安全性好和免疫途径简捷等优点，具有广阔的应用前景。本研究通过RT-PCR扩增H5N1亚型禽流感病毒A/wild duck/Shandong/628/2011（SD628）（Clade2.3.4）和A/wild duck/Shandong/2/2011（SD2）（Clade2.3.2.1）的HA基因，将其克隆到pShuttle-CMV中构建重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-SD628-HA和pShuttle-CMV-SD2-HA。采用Ad-Easy技术，制备表达禽流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒rAd-HA（rAd-SD628-HA和rAd-SD2-HA），将其感染AD293细胞后，可产生明显的细胞病变，通过细胞超薄切片可观察到完整的腺病毒。经RT-PCR、间接免疫荧光及westernblot证明HA基因在AD293细胞中成功转录和表达，并且表达的蛋白具有良好的生物学活性。用腺病毒纯化试剂盒纯化P4代重组腺病毒，测其TCID50值，rAd-SD628-HA的病毒滴度为1010TCID50/mL；rAd-SD2-HA的病毒滴度为7.5×109TCID50/mL。rAd-SD628-HA经肌肉注射和滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫剂量分别为108TCID50/只，5×108TCID50/只。初免3周后，采用同种剂量、同种途径进行加强免疫。以病毒中和试验（VN）检测小鼠血清抗体效价，二免1周，肌肉注射免疫组和滴鼻免疫组中和抗体效价达到最高分别达到1:113，1:66，中和抗体效价呈明显的上升趋势。同源SD628病毒攻毒后，腺病毒疫苗免疫组小鼠状态良好，无小鼠死亡，体重未出现明显波动。对照组小鼠精神萎靡，皮毛粗糙，体重持续下降，最低下降到原体重的81%，并且有2只小鼠死亡。以上结果表明：rAd-SD628-HA经肌肉和鼻粘膜两种途径免疫BALB/c小鼠均能够诱导良好的免疫应答反应，保护小鼠抵抗致死剂量H5N1流感病毒的攻击。rAd-SD628-HA采用肌肉注射的方式免疫SPF鸡，初免3周后，加强免疫。二免2周后，分别用106EID50剂量的同源病毒SD628、异源病毒SD2进行攻毒。血凝抑制试验（HI）检测鸡血清抗体效价。SD628攻毒组的SPF鸡以抗原A/wild duck/Shandong/628/2011（H5N1）检测HI抗体效价，攻毒前，二免2周HI抗体效价达到最高；108TCID50剂量组、109TCID50剂量组和Re-6灭活疫苗免疫组HI抗体效价分别达到9log2，9.16log2，6.88log2。同源SD628病毒后，108TCID50剂量组有1只鸡死亡（保护率87.5%），3只鸡排毒；109TCID50剂量组没有鸡死亡，未出现鸡排毒（保护率100%）；Re-6疫苗组有3只鸡排毒，没有鸡死亡（保护率100%）；对照组的鸡全部死亡。结果表明：针对同源病毒的攻击，rAd-SD628-HA以109TCID50剂量免疫SPF鸡在保护力和抑制排毒等方面都优于108TCID50剂量，保护效果与灭活疫苗无显著差别。rAd-SD628-HA免疫SPF鸡后，SD2攻毒组的SPF鸡以抗原A/wild duck/Shandong/2/2011（H5N1）检测HI抗体效价，二免2周，109TCID50剂量组和Re-6灭活疫苗组抗体效价分别达到4log2，10.88log2。异源SD2病毒攻毒2周后，腺病毒免疫组抗体效价明显升高达到6.14log2，Re-6灭活疫苗免疫组抗体效价略有上升达到11.14log2。同时，109TCID50剂量组和Re-6疫苗组的SPF鸡均未出现死亡情况（保护率100%），但是，109TCID50剂量组有4只鸡排毒，Re-6疫苗组鸡未出现排毒，对照组的鸡全部死亡。结果表明：rAd-SD628-HA以109TCID50剂量免疫SPF鸡，也能抵御异源病毒的致死性攻击。本研究构建的H5N1亚型禽流感病毒重组腺病毒活载体疫苗在BALB/c小鼠和SPF鸡上均能够诱导高水平的抗体，并且可以完全保护小鼠和鸡抵抗致死性AIV的攻击，为新型流感疫苗的研发提供了理论依据。

全文目录


目录  4-6
CONTENTS  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-22
  1.1 禽流感病毒概况  12-14
    1.1.1 禽流感病毒的结构特点  12-13
    1.1.2 病毒病原性的决定因素  13-14
    1.1.3 H5N1 亚型高致病性禽流感病毒的发展历史及现状  14
  1.2 禽流感疫苗的研究进展  14-17
    1.2.1 细胞源性全病毒灭活疫苗  14-15
    1.2.2 VLPS 疫苗  15
    1.2.3 DNA 疫苗  15
    1.2.4 病毒活载体疫苗  15-17
  1.3 腺病毒表达系统  17-21
    1.3.1 腺病毒的结构及感染机理  17-18
    1.3.2 腺病毒表达系统的构建  18-20
    1.3.3 腺病毒载体的优点  20
    1.3.4 腺病毒表达系统在禽流感疫苗中的应用  20-21
  1.4 研究的目的和意义  21-22
2 材料与方法  22-32
  2.1 试验材料  22-23
    2.1.1 病毒株、菌株、细胞与实验动物  22
    2.1.2 载体和疫苗  22
    2.1.3 生物学试剂  22
    2.1.4 主要仪器  22-23
    2.1.5 分子生物学软件  23
  2.2 试验方法  23-32
    2.2.1 PCR 引物设计与合成  23
    2.2.2 重组腺病毒穿梭质粒 pShuttle-CMV-HA 的构建  23-25
    2.2.3 重组腺病毒质粒 pAdEasy-HA 的构建  25-26
    2.2.4 重组腺病毒 rAd-HA 的制备  26-27
    2.2.5 重组腺病毒 rAd-HA 的鉴定  27-28
    2.2.6 重组腺病毒的浓缩纯化及滴度测定  28-29
    2.2.7 rAd-SD628-HA 对 BALB/c 小鼠的免疫效力  29-30
    2.2.8 rAd-SD628-HA 对 SPF 鸡的免疫效力  30-32
3 结果  32-43
  3.1 重组质粒的构建及鉴定  32-34
    3.1.1 HA 基因的扩增  32
    3.1.2 重组腺病毒穿梭质粒 pShuttle-CMV-HA 的鉴定  32-33
    3.1.3 重组腺病毒质粒 pAdEasy-HA 的鉴定  33-34
  3.2  34-37
    3.2.1 重组腺病毒的形态学观察  34-35
    3.2.2 rAd-HA 在 AD293 细胞中的转录鉴定  35
    3.2.3 HA 蛋白表达的间接免疫荧光鉴定  35-36
    3.2.4 HA 蛋白表达的 western blot 鉴定  36-37
  3.3  37
    3.3.1 腺病毒纯化试剂盒浓缩纯化腺病毒  37
    3.3.2 重组腺病毒 rAd-HA 的 TCID50的测定  37
  3.4 重组腺病毒活载体疫苗免疫效果的评价  37-43
    3.4.1 BALB/c 小鼠免疫效果评价  37-39
    3.4.2 SPF 鸡免疫效果评价  39-43
4 讨论  43-45
5 全文结论  45-46
致谢  46-47
参考文献  47-54
附录  54-56
攻读硕士期间发表的论文  56

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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