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两株H5N1亚型禽流感病毒对SPF鸭的致病性研究

作　者: 杨德全
导　师: 张书霞；李雁冰
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: SPF鸭 H5N1亚型禽流感病毒 致病性 细胞免疫功能 遗传演化分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


本试验利用2株1996年和2004年从我国广东地区分离的H5N1亚型禽流感病毒感染4周龄SPF鸭,针对H5N1亚型禽流感病毒对SPF鸭的致病性进行了系统研究。以106 EID50的病毒量鼻腔感染SPF鸭后,于第3、5、7、9 d分别剖杀感染鸭3只,采集喉头拭子、泄殖腔拭子、各组织脏器,进行病毒含量滴定、荧光定量PCR检测、病理组织学和免疫组织化学检验,探讨了H5N1亚型禽流感病毒在鸭体内各脏器的含量、分布、引起的病理变化以及排毒情况。2株禽流感病毒对鸭表现为不同的致病性:GS/GD/1/96毒株对SPF鸭的致死率为0,且无临床症状,剖检后无肉眼可见病理变化,各器官均分离不到病毒,免疫组织化学检测未发现病毒抗原信号;而DK/GDJD/23/04毒株对SPF鸭的致死率为100%,且表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,胸腺出血,脾脏肿大并有坏死灶,肺脏严重充血、出血,腺胃粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征的病理变化。各器官均可分离到病毒,脑组织病毒含量最高,免疫组织化学检测发现有病毒抗原信号。应用ELISA、细胞培养技术及CCK测定法,对4周龄SPF鸭感染H5N1 AIV后,其血清中IL-2、IFN-γ的含量,脾脏淋巴细胞对ConA刺激的T淋巴细胞增殖功能动态变化的研究发现,GS/GD/1/96毒株可促使外周血淋巴细胞分泌和释放IL-2和IFN-γ（p＜0.05）,但不能引起外周血T淋巴细胞的转化率的变化;而DK/GDJD/23/04毒株不仅可促使外周血淋巴细胞合成和释:IL-2（p＜0.05）和IFN-γ（p＜0.01）,最主要的是能引起外周血T淋巴细胞的转化率显著降低（P＜0.01）,并引起脾、胸腺及盲肠扁桃体的出血和淋巴细胞减少的变化,说明该病毒具有显著的抑制鸭细胞免疫功能的作用。进一步证实了DK/GDJD/23/04毒株感染后可引起鸭免疫功能抑制。全基因组测序分析表明,2株病毒均为高致病性毒株,在分子结构上,二者HA蛋白上的糖基化位点完全一致,二者HA蛋白的差异有2处,一是DK/GDJD/23/04裂解位点为连续的5个碱性氨基酸（-RRRKK-）,GSGD/1/96为6个连续的碱性氨基酸（-RRRKKR-）;二是在可能的受体结合位点224-229位,DK/GDJD/23/04的氨基酸为RLVPKI,而GSGD/1/96的序列为RLVPEI,即228位氨基酸E到K的变化。二者NA蛋白的差异有2处,一是DK/GDJD/23/04在NA蛋白颈部49-68位缺20个氨基酸,相应的缺失了4个潜在糖基化位点。GSGD/1/96 NA蛋白颈部没有发生缺失。二是DK/GDJD/23/04NA蛋白在386位有糖基化位点,而GSGD/1/96 NA蛋白在386位没有糖基化位点。DK/GDJD/23/04的NA蛋白颈部49-68位20个氨基酸缺失、NS1蛋白在80-84位有5个氨基酸缺失,这些缺失存在于大多数H5N1亚型人源和禽源分离株中,有利于禽流感病毒在家禽中传播,成为2002-2004年流行的优势病毒。上述这些差异可能是2株病毒对鸭致病性差异的重要原因。遗传演化分析表明,二株病毒存在差异,DK/GDJD/23/04与04年及以后的流行株亲缘关系很近,此毒株已在家禽中传播并发生了变异。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
综述部分  10-32
  文献综述  12-32
    1 禽流感病毒的结构及组成  12-13
    2 禽流感病毒的复制  13-14
    3 禽流感病病毒的抗原变异机理  14
    4 禽流感病毒的致病性  14-23
      4.1 禽流感病毒致病性的分子基础  15-21
      4.2 禽流感病毒的宿主特异性分子基础  21-23
    5 禽流感病毒与宿主的免疫反应  23-27
      5.1 体液免疫  23-24
      5.2 细胞免疫  24-27
    6 禽流感病毒的生态学  27-30
      6.1 水禽在禽流感病毒生态学中的地位  27-28
      6.2 禽流感的公共卫生意义  28-30
    7 本研究的目的和意义  30-32
试验部分  32-72
  第一章 两株H5N1亚型禽流感病毒对SPF鸭的感染性  34-50
    1 材料与方法  35-38
      1.1 毒株  35
      1.2 实验动物  35
      1.3 试剂及主要仪器  35
      1.4 感染用毒株鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定  35-36
      1.5 感染用毒株对鸡胚、鸭胚的致病力比较  36
      1.6 SPF鸭的感染试验  36-38
    2 结果  38-46
      2.1 感染用毒株鸡胚、鸭胚半数感染量(EID_(50))的测定  38-39
      2.2 感染鸭的临床症状、死亡情况、剖检变化、组织病理学变化  39-43
      2.3 脏器及拭子中的病毒含量测定  43-46
      2.4 病毒在鸭体内的分布  46
    3 讨论  46-50
      3.1 两株H5N1亚型禽流感病毒对鸭的致病性比较  46-48
      3.2 DK/GDJD/23/04病毒在鸭脏器内的分布及含量  48-49
      3.3 DK/GDJD/23/04病毒致鸭死亡的可能机制  49-50
  第二章 两株H5N1亚型禽流感病毒感染对SPF鸭细胞免疫功能影响的初探  50-58
    1 材料与方法  51-52
      1.1 毒株  51
      1.2 实验动物  51
      1.3 试剂及主要仪器  51
      1.4 SPF鸭的感染试验  51-52
      1.5 数据处理  52
    2 结果  52-55
      2.1 感染后第3、5、7、9 d SPF鸭血清中IL-2的变化  52-53
      2.2 感染后第3、5、7、9 d SPF鸭血清中IFN-γ的变化  53-54
      2.3 感染鸭脾脏T淋巴细胞增殖功能的变化  54-55
    3 讨论  55-58
  第三章 两株H5N1亚型禽流感病毒对SPF鸭致病性分子基础的探讨  58-72
    1 材料与方法  59-65
      1.1 毒株  59
      1.2 SPF鸡胚  59
      1.3 主要试剂与仪器  59-60
      1.4 引物  60
      1.5 病毒RNA的提取  60
      1.6 cDNA合成  60
      1.7 聚合酶链式反应(PCR)  60-61
      1.8 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物  61
      1.9 PCR产物回收和纯化  61
      1.10 PCR回收产物鉴定  61
      1.11 大肠杆菌感受态细胞的制备  61-62
      1.12 目的基因DNA产物的连接与转化  62
      1.13 阳性质粒的筛选  62
      1.14 粗提质粒  62
      1.15 质粒DNA纯化  62-63
      1.16 重组质粒的PCR鉴定  63-64
      1.17 DNA测序  64-65
      1.18 序列的拼接分析  65
    2 结果  65-69
      2.1 RT-PCR结果  65
      2.2 序列测定及表面蛋白进化分析结果  65-69
    3 讨论  69-72
全文总结  72-74
参考文献  74-84
附录Ⅰ  84-91
附录Ⅱ  91-92
致谢  92

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