学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

不同亚型猪流感病毒HA1重组蛋白的制备及H5亚型猪流感抗体ELISA检测技术研究

作　者: 尹可
导　师: 黎满香；周继勇
学　校: 湖南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流感 HA基因 原核表达 蛋白纯化 间接ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 123次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


将H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型猪流感病毒（SIV）接种9-11日龄SPF鸡胚,收集24h-96h死亡鸡胚的尿囊液,测定病毒血凝效价;经2%甲醛37℃灭活48h并浓缩,制备了猪流感免疫抗原;选取无SIV感染的健康猪进行免疫,分别制备了抗H1、H3、H5和H9亚型SIV阳性血清250-300ml,HI效价达1/640。根据H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型SIV的HA基因序列设计特异性引物,以RT-PCR从病毒尿囊液中扩增H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亚型SIV浙江株HA1基因,分别克隆到pET-28a（+）和pET32a（+）原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-HA1/H1、pET28a-HA1/H3、pET32a-HA1/H3、pET28a-HA1/H5、pET32a-HA1/H9;将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,pET28a-HA1/H1、pET28a-HA1/H3、pET32a-HA1/H3、pET28a-HA1/H5、pET32a-HA1/H9,在大肠杆菌中成功表达His-HA1/H1（45kDa）、His-HA1/H3（45kDa）、Trx-His-HA1/H3（58 kDa）、His-HA1/H5（45kDa）和Trx-His-HA1/H9（56kDa）融合蛋白,表达蛋白均可被抗His单克隆抗体和相应亚型猪流感阳性血清特异识别,表明融合蛋白具有良好的免疫学活性。诱导表达条件优化结果表明,诱导菌体OD600=0.3-1.0、0.1mM IPTG、37℃诱导4h为最佳表达条件;可溶性分析显示表达蛋白主要以不溶性包涵体形式存在。采用咪唑竞争结合法在变性条件下以Ni-NTA亲和纯化重组蛋白,以BCA法测定重组蛋白浓度,测得表达蛋白的产量分别为:18mg/L（pET28a-HA1/H1）、15mg/L（pET28a-HA1/H3）、10mg/L（pET32a-HA1/H3）、15mg/L（pET28a-HA1/H5）、12mg/L（pET32a-HA1/H9）培养物。用纯化的H5亚型SIV HA1重组蛋白作为检测抗原,建立了检测SI抗体的间接ELISA方法,并确定了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为0.31μg/孔,包被液为0.05M Tris-HCl缓冲液（pH8.5）;待检血清稀释度1:100;封闭液为5%脱脂奶,样品稀释液为含0.1%BSA、0.05%吐温-20的磷酸缓冲液;待检血清反应条件为37℃45 min,二抗为37℃30 min,底物溶液显色条件为37℃显色10min。特异性试验表明:上述ELISA方法特异检出H5亚型SIV抗体,与H1、H3或H9亚型SIV,以及猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等相关猪病阳性血清无交叉反应。重复性试验结果显示:同批抗原制备的不同检测板的批内变异系数（CV）值在2.6-14%之间,不同批抗原制备的检测板的批间CV值在19%以下。对临床猪血清的检测表明,ELISA方法与血凝抑制试验（HI）的阳性符合率为75.0%,阴性符合率为81.9%,总符合率为81.4%。ELISA方法对人工免疫猪流感抗体消长规律的检测结果也与HI相符,表明所建立ELISA方法能够检测抗体动态变化,为SIV的诊断与抗体监测提供了一种理想的技术手段。

全文目录


相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  5. 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
  6. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  7. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  8. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  9. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  10. 免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒融合蛋白方法的建立,R373
  11. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  12. IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用,S852.65
  13. 犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立,S852.65
  14. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  15. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  16. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  17. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  18. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  19. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  20. 华东地区鸭圆环病毒感染流行病学调查及其单克隆抗体的制备,S858.32
  21. 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立及NS、NP蛋白细胞定位研究,S858.28

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
© 2012 www.xueweilunwen.com