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牛源性重组金黄色葡萄球菌β-溶血素亚单位疫苗对金黄色葡萄球菌诱导的乳腺内感染小鼠的保护研究

作　者: 魏春梅
导　师: 彭广能；杨宏军
学　校: 四川农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 金葡菌 β-溶血素亚单位疫苗模型免疫效力小鼠
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本试验通过采用金葡菌Newbould305建立了小鼠泌乳期乳腺内感染的乳腺炎动物模型,并在此基础上探讨牛源性重组金葡菌β-溶血素(P-hemolysin,β-HL)亚单位疫苗对小鼠乳腺局部、整体的防御体系及炎症相关因子的影响,为乳腺炎的生物防治提供新思路。1.牛源性金葡菌攻击下小鼠泌乳期感染模型的建立选择48只未孕雌鼠随机分为6组(n=8),产后7-10d分别在小鼠的第四对乳腺内灌注经过毒力活化的细菌悬液5.0×10~2CFU/50μL (E1)、1.0×10~3CFU/50μL (E2)、5.0×10~3CFU/50μL (E3)、1.0×10~4CFU/50μL (E4)和1.0×10~5CFU/50μL (E5),对照组小鼠乳腺内注入同剂量的无菌的PBS,48h处死。观察小鼠乳腺组织中细菌数量、TNF-α、IL-2和IL-6含量的变化及乳腺组织形态学观察。结果表明实验组乳腺组织中分离到细菌数呈现先升高后下降的趋势,E3达到最高。组织形态学上对照组腺泡结构完整, E1组和E2组腺泡内主要以浆液性渗出为主,E3组腺泡壁增厚,腺泡腔内嗜中性粒细胞(PMN)增多,随着剂量的增大E4和E5组腺泡壁破裂,甚至个别样品出现坏死灶。与对照组相比,E3组小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-2和IL-6含量极显著升高(P<0.01),整体来看呈先升高后下降的趋势。由结果可知5.0×10~3CFU/50μl(E3)剂量下的金葡菌攻击下的小鼠乳腺炎性反应与炎症的免疫病理过程一致,故选择此剂量作为小鼠乳腺内感染的病理模型的造模剂量。2.重组金葡菌p-溶血素亚单位疫苗对小鼠金葡菌性乳腺炎的保护效果研究48只雌鼠随机分成对照组、造模组、pET-32a(+)质粒蛋白免疫不攻毒组、pET-32a(+)质粒蛋白免疫攻毒组、β-HL免疫不攻毒组、β-HL免疫攻毒组(n=8),用Ni-NTA Agarose纯化目的蛋白,Bradfrod法对目的蛋白进行蛋白含量测定,无菌将蛋白制作成疫苗免疫小鼠。产后7-10天分别在小鼠的第四对乳腺内灌注经过毒力活化的细菌悬液5.0×10~3CFU/50μL,用ELISA方法测定抗体效价,并分离攻毒后小鼠乳腺中细菌、观察乳腺匀浆中细胞因子的含量变化及通过琼脂糖免疫双向扩散试验观察pET-32a(+)载体对金葡菌重组β-溶血素的影响。结果表明纯化的β-HL和pET-32a (+)质粒蛋白分别在57kD和20.5kD处显示单一条带,蛋白含量分别为950μg/ml和1.45mg/ml;β-HL重组蛋白和pET-32a(+)质粒蛋白免疫小鼠都能产生相应的抗体,随着免疫次数的增加,产生的相应抗体滴度也逐渐增加；pET-32a(+)免疫攻毒组和β-HL免疫攻毒组乳腺匀浆中的TNF-α和IL-2的含量与空白攻毒组相比有所变化,但差异不显著(P>0.05),之间不存在统计学意义,但与各自相应对照组之间存在统计学意义。而pET-32a(+)免疫攻毒组乳腺匀浆中的IL-6含量与空白攻毒组之间,二者存在统计学意义(P<0.05),而p-HL免疫攻毒组则变化不大；通过琼脂糖免疫双向扩散试验,抗重组β-HL抗体和抗pET-32a(+)载体蛋白的抗体都与金葡菌Newbould305超声波破碎液形成沉淀线。由结果可知纯化的目的蛋白达到电泳级纯度；蛋白疫苗作用机体能够产生较高的抗体水平；pET-32a(+)质粒蛋白可以增加β-HL蛋白的抗原性。总之,金葡菌重组β-溶血素亚单位疫苗对由金葡菌菌株Newbould305诱导的乳腺炎并不能减轻小鼠乳腺的炎症状态,但一定程度上能够减少小鼠乳腺内细菌的数量。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
本文部分缩写的中英文对照  11-12
第一章文献综述  12-28
  1. 前言  12-21
    1.1 奶牛乳腺炎的危害  12-13
    1.2 奶牛乳腺的防御系统  13-15
    1.3 细菌性乳腺炎的病理过程及持续存在的机制  15-16
    1.4 细菌性乳腺炎的疫苗预防研究进展  16-19
    1.5 金葡菌的生物学特性  19-21
  2. 金葡菌β-溶血素研究进展  21-25
    2.1 金葡菌β-溶血素的制备和纯化  21-22
    2.2 金葡菌β-溶血素的性质  22-25
    2.3 影响金葡菌β-溶血素活性的各种因素  25
  3. 小鼠模型在研究奶牛金葡菌乳腺炎中的应用  25-26
  4. 本试验的研究目的和意义  26-28
第二章实验内容  28-54
  实验一、牛源性金葡菌攻击下小鼠泌乳期感染模型的建立  28-38
    1. 试验材料  28-29
      1.1 菌株  28
      1.2 主要药品与试剂  28
      1.3 主要溶液的配置  28
      1.4 主要仪器  28-29
    2. 试验方法  29-32
      2.1 细菌毒力活化  29
      2.2 试验动物  29
      2.3 小鼠试验性乳腺炎模型的建立  29
      2.4 取材  29-30
      2.5 乳腺病理组织形态学观察  30
      2.6 乳腺匀浆液中细胞因子的变化  30-31
      2.7 数据统计与分析  31-32
    3. 结果  32-36
      3.1 菌株毒力变化  32
      3.2 各造模剂量下乳腺组织中分离到的金葡菌数量的变化  32-33
      3.3 乳腺病理形态学观察  33
      3.4 乳腺内TNF-α、IL-2和IL-6标准曲线的绘制及含量的变化  33-36
    4. 讨论  36-38
  实验二、重组金葡菌β-溶血素亚单位疫苗对小鼠金葡菌性乳腺炎的保护效果研究  38-54
    1. 试验材料  38-41
      1.1 试验动物  38
      1.2 攻毒细菌准备  38
      1.3 菌种和质粒  38
      1.4 主要试剂  38
      1.5 主要试剂的配置  38-40
      1.6 主要仪器  40-41
    2. 实验方法  41-46
      2.1 β-HL目的蛋白和pET-32a (+)空载体的诱导表达和纯化  41-42
      2.2 目的蛋白的定量检测  42-43
      2.3 亚单位疫苗的制作  43
      2.4 疫苗的无菌检验及安全检验  43
      2.5 免疫程序  43-44
      2.6 测定指标与方法  44-46
      2.7 数据统计与分析  46
    3. 结果与分析  46-51
      3.1 β-HL融合蛋白和pET-32a (+)空载体的诱导表达和纯化  46-47
      3.2 蛋白标准曲线的制作与目的蛋白含量测定  47-48
      3.3 疫苗无菌和安全检验  48
      3.4 间接ELISA检测抗体效价  48-49
      3.5 乳腺组织细胞因子的变化  49
      3.6 乳腺病理组织形态学观察  49-50
      3.7 β-HL融合蛋白和pET-32a(+)空载体蛋白两种抗原性检测  50-51
    4. 讨论  51-54
      4.1 对乳腺组织的保护作用  51
      4.2 对乳腺组织中TNF-α、IL-2和IL-6水平的影响  51-53
      4.3 血清中特异性抗体水平的变化及pET-32a-载体对金葡菌重组β-溶血素的影响  53-54
结论  54-55
参考文献  55-62
致谢  62-63
攻读学位期间发表的学术论文目录  63

牛源性重组金黄色葡萄球菌β-溶血素亚单位疫苗对金黄色葡萄球菌诱导的乳腺内感染小鼠的保护研究

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