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PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及与PCV2灭活抗原免疫效果的比较

作　者: 刘宗争
导　师: 尹逊河
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: ORF2 基因表达免疫效力
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type2, PCV-2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、皮炎和肾病综合症(PDNS)和猪呼吸道病复合征(PRDC)等多种疾病的主要病原之一。其流行广泛及造成的巨大经济损失,已引起世界养猪业的重视。PCV-2 ORF2编码的结构蛋白具有有型特异性抗原决定簇,因此它是区分PCV-1和PCV-2的重要抗原,它有望在血清学诊断中发挥作用。国内外研究证明,Cap蛋白可以诱导机体产生一定水平的抗体,对机体产生免疫保护作用,是构建重组疫苗和检测的首选基因。本研究通过PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中获得表达蛋白,采用不同剂量的表达蛋白和PCV2灭活抗原分别与弗氏不完全佐剂乳化配制疫苗,以猪作为动物模型,观察其免疫效果。试验一PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达根据已发表的PCV-2 ORF2基因序列,设计合成一对引物,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,获得一约531bp的特异性片段,与预期结果相符。经序列测定,其序列与目的基因序列一致。将PCR的扩增产物经酶切后连入pET-32a载体,构建重组质粒,证明成功构建了重组表达质粒pET32a-ORF2。筛选的阳性重组质粒pET32a-ORF2和空表达载体pET32a经PCR和酶切鉴定,经测序后,分别转化大肠杆菌BL21,用1 mmol/L的IPTG于37℃进行诱导表达,PCV-2 ORF2编码的蛋白片段在大肠杆菌E.coli BL21中以包涵体的形式得到大量表达。分别取诱导后1、2、3、4、5、6h后的诱导产物进行SDS-PAGE分析。分析证明诱导表达6 h内,蛋白表达量与随诱导时间增加而增加,在5h蛋白表达量达到最大值。表达产物经包涵体洗液纯化后,Western blot可见有特异性条带产生,获得了理想的纯化效果,表达的重组蛋白能被PCV-2的单克隆抗体所识别试验二表达的cap蛋白与PCV2灭活抗原免疫效果的比较将稀释至2.5mg/ml、1.25 mg/ml的表达蛋白和稀释至105TCID50/ml的PCV2灭活抗原分别与弗氏不完全佐剂乳化配制疫苗。将20头30日龄左右的PCV2抗体及抗原阴性的的仔猪随机分为4组,每组5头,分别肌肉注射以上三种配制的疫苗及PBS各2ml、。首免后3周加强免疫,加强免疫后3周攻毒。攻毒后分别在第4、7天用钥匙孔血蓝蛋白(KLH)进行免疫刺激,并在攻毒后第4、7、11、19天用巯基乙酸培养基刺激,隔离饲养观察,30天后全部宰杀。首免后定期采血测其ELISA抗体水平、中和抗体水平,攻毒后通过临床表现及体温变化、相对日增重、病毒血症、排毒情况及解剖时的病理变化等指标评价疫苗效果。结果为：第一组刺激机体产生的ELISA抗体水平、中和抗体水平明显高于其他免疫组和攻毒对照组(P<0.01)。攻毒后,第一组仔猪在相对日增重高于其他各组(P<0.01),攻毒期间体内带毒和体外排毒的仔猪数量最少(各2头),带毒与排毒的持续时间最短(分别在第11天和第7天消失)；病理切片显微观察显示,攻毒后第一组的组织病理变化最为轻微。这些数据证明2.5mg/ml的表达蛋白配制的疫苗效果明显优于其他疫苗。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
引言  11
1 猪圆环病毒的由来  11-12
2 PCV的基因组及其编码的蛋白  12-15
3 PCV2的免疫特性  15-18
  3.1 PCV2引起的淋巴细胞的变化  15-16
  3.2 PCV2病毒在机体内的分布  16
  3.3 PCV2与其他因子的共刺激  16-17
  3.4 对细胞因子表达的影响  17-18
4 PCV2的流行病学  18
5 PCV2造成的疾病  18-24
  5.1 猪断奶后多系统功能衰竭综合症(PMWS)  19-20
  5.2 猪皮炎和肾病综合症(PDNS)  20-21
  5.3 先天性震颤(CT)  21-22
  5.4 渗出性皮炎(Exudative epidermitis)  22
  5.5 猪呼吸道病综合征(PRDC)  22-23
  5.6 坏死性淋巴腺炎(Necrotizing lymphadenitis)  23
  5.7 PCV2相关性繁殖障碍(Reproductive failure)  23-24
  5.8 肉芽肿性肠炎(Granulomatous enteritis)  24
6 抗原的实验室检测  24-29
  6.1 病毒分离及电镜观察  24
  6.2 间接免疫荧光法(IFA)  24-25
  6.3 原位杂交  25
  6.4 免疫组织化学(IHC)  25
  6.5 免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)  25-26
  6.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)  26-27
  6.7 酶免疫试验(EIA)  27
  6.8 聚合酶链式反应(PCR)  27-29
  6.9 环介导恒温扩增(LAMP)  29
  6.10 限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)  29
7 疫苗的研究现状  29-32
  7.1 弱毒疫苗  30
  7.2 核酸疫苗  30-31
  7.3 重组亚单位疫苗  31-32
  7.4 活载体疫苗  32
8 本课题的研究内容和意义  32-34
试验一 PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达  34-45
  1 材料和方法  34-40
    1.1 材料  34
    1.2 试验方法  34-40
  2 结果与分析  40-42
    2.1 PCR扩增  40
    2.2 重组质粒pET32a-ORF2的酶切鉴定  40-41
    2.3 表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析  41-42
  3 讨论  42-45
    3.1 目的基因的扩增与克隆  42-43
    3.2 重组质粒的表达  43
    3.3 重组蛋白的表达形式  43
    3.4 包涵体的分离提取  43-45
试验二表达的Cap蛋白与PCV2灭活抗原免疫效果的比较  45-54
  1 材料和方法  45-48
    1.1 材料  45
    1.2 试验方法  45-48
  2 结果与分析  48-52
    2.1 疫苗安全性及临床表现  48-49
    2.2 ELISA抗体动态变化  49
    2.3 二免后中和抗体水平  49-50
    2.4 病毒血症  50
    2.5 攻毒后的排毒情况  50-51
    2.6 病理观察  51-52
  3 讨论  52-54
结论  54-55
参考文献  55-66
附图  66-68
致谢  68-69
攻读学位期间发表的论文  69

PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及与PCV2灭活抗原免疫效果的比较

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