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H5N1亚型高致病性禽流感病毒RNA聚合酶PB1B亚基的表达及初步晶体学研究

作　者: 薛海山
导　师: 吴德峰；庞海
学　校: 福建农林大学
专　业: 基础兽医学
关键词: H5N1亚型禽流感病毒聚合酶蛋白纯化结晶 X-衍射
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

禽流感(avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒(avian influenza A virus,AIV)引起的禽类烈性传染病。1997年,以往仅能感染致死禽类的H5N1亚型高致病性禽流感病毒在香港特区引起人感染,导致18人入院治疗,6人死亡,死亡率达33.3%,这是全球首次发现禽流感病毒能直接感染人,引起了科学界的轰动。自2003年以来至今短短的几年间,报道禽流感病毒感染384例,死亡241例,死亡率惊人,高达62.8%。可见禽流感病毒给人类带来了严峻的挑战,具有极其重要的公共卫生学意义。禽流感病毒的核酸是负链单股RNA,其基因组共由8个独立的RNA片段组成。其中PB1在聚合酶的催化中起中央调控作用。它包含RNA依赖RNA的蛋白基序,直接参与RNA链的延伸。PB1B是禽流感病毒聚合酶蛋白PB2亚基与PB1亚基的结合位点,由于缺乏结构相关的数据,聚合酶蛋白催化功能的具体机制尚有待研究,我们将采用晶体学方法探明流感病毒RNA聚合酶的结构、相互作用位点和作用方式。本实验将PB1B基因进行体外扩增,在Escherichia coli中得到了高效的表达,经Ni-NTA亲和层析、Resource Q离子交换层析和Superdex-75凝胶层析分离等技术进行了目标蛋白的分离纯化。采用悬滴气相扩散法对蛋白进行结晶。筛选和优化结晶条件,获得适合X-射线衍射的不同空间群的晶体,并分别收集高质量的X衍射数据。实验结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a-PB1B,并对其进行诱导表达,获得可溶性蛋白。通过优化纯化条件,获得了高纯度的目标蛋白。所得的纯化蛋白的分子量约为47kDa。在结晶溶液中,纯化的目标蛋白PB1B具有良好的均一性,适合蛋白结晶。经X线照射,获得了两种不同结晶条件下的适合X-射线衍射的两种不同空间群的晶体。

全文目录

中文摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-12
1 前言  12-18
  1.1 禽流感及聚合酶蛋白概述  12-13
  1.2 禽流感病毒RNA 聚合酶蛋白催化功能及机制  13-15
  1.3 禽流感病毒RNA 聚合酶蛋白的结构研究  15-16
  1.4 流感病毒RNA 聚合酶亚基的功能  16
  1.5 禽流感病毒聚合酶蛋白的研究现状与潜在的应用前景  16
  1.6 本课题研究的目的意义及研究内容  16-18
2 材料与方法  18-27
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 质粒和菌株  18
    2.1.2 主要试剂  18
    2.1.3 蛋白质纯化相关仪器与材料  18-19
  2.2 实验方法  19-27
    2.2.1 聚合酶蛋白亚基PB1B 的生物信息学分析  19
    2.2.2 重组蛋白PB1B 的构建  19-23
    2.2.3 重组蛋白PB1B 的表达  23-25
    2.2.4 蛋白质分离纯化  25
    2.2.5 蛋白质结晶及衍射数据收集  25-26
    2.2.6 蛋白结构的解析  26-27
3 结果与分析  27-43
  3.1 重组蛋白PB1B 的生物信息学分析  27-30
    3.1.1 基本理化性质分析结果  27-28
    3.1.2 蛋白的跨膜区分析结果  28
    3.1.3 结构域预测结果  28-29
    3.1.4 同源性分析结果  29
    3.1.5 蛋白的功能预测结果  29-30
  3.2 重组蛋白的构建表达及纯化  30-36
    3.2.1 聚合酶蛋白PB1B 重组质粒的构建  30
    3.2.2 聚合酶蛋白PB1B 的表达  30-31
    3.2.3 PB1B 的全波长扫描  31-32
    3.2.4 聚合酶蛋白PB1B 的纯化  32-34
    3.2.5 纯化蛋白PB1B 的纯度测定  34-35
    3.2.6 纯化蛋白PB1B 在结晶缓冲液中的均一性分析  35-36
  3.3 蛋白质结晶  36-43
    3.3.1 PB1B 的结晶条件的初步筛选  36
    3.3.2 PB1B 结晶条件的优化  36
    3.3.3 PB1B 蛋白的两种晶体  36-37
    3.3.4 PB1B 晶体的X 衍射数据的收集和处理  37-40
    3.3.5 PB1B 晶体结构解析的尝试  40-43
4 讨论  43-52
  4.1 蛋白质生物信息学预测  43
  4.2 基因克隆、表达、纯化及生化性质初步分析  43-47
    4.2.1 基因克隆与蛋白表达  44
    4.2.2 蛋白的分离和纯化  44-46
    4.2.3 蛋白样品均一性的检测  46-47
  4.3 蛋白的结晶和初步晶体学研究  47-52
    4.3.1 蛋白质结晶  47-48
    4.3.2 蛋白结晶条件的优化  48-49
    4.3.3 蛋白质X 衍射数据的收集和处理  49-50
    4.3.4 蛋白结构的解析  50-52
全文总结  52-53
参考文献  53-58
致谢  58

H5N1亚型高致病性禽流感病毒RNA聚合酶PB1B亚基的表达及初步晶体学研究

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