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茶树类黄酮3’，5’-羟基化酶的基因克隆与功能研究

作　者: 陈啸天
导　师: 王云生; 夏涛
学　校: 安徽农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 茶树类黄酮-3’5’-羟基化酶基因克隆原核表达真核表达转基因酶活分析
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

儿茶素类(catechins)为2-苯基苯并吡喃衍生化合物，属黄烷醇类化合物，主要类型包括儿茶素(catechin, C)、没食子儿茶素(gallocatechin, GC)、表儿茶素(epicatechin,EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)以及表儿茶素类酯化产物(包括表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate, EGCG)。其中， C、EC和ECG为2-苯基苯并吡喃B环3’4’-二羟基的儿茶素，GC、EGC、EGCG为B环3’4’5’-三羟基的儿茶素。文献表明，后者中EGC及其酯化产物EGCG是茶树体内儿茶素的主要成分，约占儿茶素总量的65%。类黄酮3,5-羟化酶(flavonoid3’5’-hydroxylase, F3’5’H)是催化类黄酮B环5’羟基化反应的唯一酶系，属于细胞色素P450酶单加氧酶系。本文在克隆茶树F3’5’H基因的基础上，利用原核表达、真核酵母表达以及烟草转基因技术，验证茶树F3’5’H基因体外功能，并利用荧光实时定量PCR技术研究了类黄酮代谢相关的表达差异。研究结果如下：1、通过RACE技术克隆了可能的CsF3’5’H的全长序列，在NCBI已登录等位基因的基础上获得了5’UTR区和3’UTR区。2、通过氨基酸序列分析，推测CsF3’ H和CsF3’5’H的N段30个氨基酸左右为信号肽序列，将CsF3’H和CsF3’5’H与其他物种的CYP75序列作进化树分析，推测二者可能分别与已知的F3’H和F3’5’H同源性很高；3、构建了pET32a(+)-CsF3’5’H重组质粒，转入表达菌株rosetta(DE3)，进行原核表达。通过对诱导时间、诱导温度进行优化，确立以30℃为诱导温度，诱导5h为最佳诱导条件。使用亲和树脂纯化了CsF3’5’H融合蛋白，纯度高达86.4%。4、构建了pYES-dest52-CsF3’5’H、 pYES-dest52-VvF3’5’H、 pYES-dest52-PhF3’5’H-1、pYES-dest52-PhF3’5’H-2重组质粒，成功实现了不同来源的F3’5’H基因在酿酒酵母中的表达，并测定了部分酶对不同底物的活性，其中含pYES-dest52-VvF3’5’H、pYES-dest52-PhF3’5’H-1、pYES-dest52-PhF3’5’H-2重组质粒的菌株均对柚皮素和圣草酚具有明显催化活性。5、构建了pCB2004-CsF3’5’H重组质粒，导入农杆菌EHA105中，并成功的对烟草进行了侵染，获得了转基因烟草，经烟草粗酶酶活检测，发现转基因烟草的粗酶液可以催化柚皮素生成五羟黄酮，结果有待验证。6、通过优化了HPLC条件，建立了茶树F3’H和F3’5’H粗酶酶活的检测体系，证实茶树粗酶中确实存在F3’5’H酶的活性。7、通过实时荧光定量PCR技术技术研究了类黄酮B环羟基化相关基因在茶叶不同发育阶段的表达量。研究发现，F3’5’H在根中几乎检测不到表达量，说明其表达组织器官特异性。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
1 文献综述  9-16
  1.1 植物细胞色素 P450 概述  9
  1.2 植物 P450 基因功能研究方法  9-11
    1.2.1 酵母表达体系在植物 P450 基因功能验证中的应用  9-10
    1.2.2 植物转基因技术在植物 P450 基因功能验证中的应用  10-11
  1.3 植物类黄酮代谢相关 P450  11-16
    1.3.1 植物类黄酮代谢相关 P450 概述  11-13
    1.3.2 P450 基因在类黄酮 B 环羟基化反应中的作用  13-16
2 引言  16-18
  2.1 课题的立题背景及意义  16
  2.2 研究的主要内容  16-17
  2.3 课题来源  17-18
3 材料和方法  18-31
  3.1 实验材料  18
  3.2 菌株、质粒  18
  3.3 仪器与试剂  18-20
    3.3.1 主要药品和试剂  18
    3.3.2 主要仪器  18-19
    3.3.3 主要试剂的配方  19-20
  3.4 实验方法  20-31
    3.4.1 茶树粗酶液中 F3’5’H 酶体外活性检测  20-21
    3.4.2 基因克隆  21-24
    3.4.3 原核表达  24-26
    3.4.4 真核表达  26-27
    3.4.5 异源植物转基因功能验证  27-29
    3.4.6 表达特异性分析  29-31
4 结果与分析  31-50
  4.1 茶树 F3’5’H 基因的全长克隆  31-33
    4.1.1 RNA 质量检测  31
    4.1.2 RACE 结果  31-33
  4.2 P450 生物信息学分析  33-36
    4.2.1 F3’5’H 基因组信息分析  33
    4.2.2 CsF3’5’H 和 CsF3’H 序列分析  33-35
    4.2.3 CsF3’5’H 进化树分析  35-36
  4.3 CSF3’5’H 在大肠杆菌中的表达、温度条件的优化及蛋白纯化  36-38
    4.3.1 原核表达  36-37
    4.3.2 原核表达条件优化  37
    4.3.3 CsF3’5’H 融合蛋白的纯化  37-38
  4.4 真核表达  38-44
    4.4.1 CsF3’5’H、VvF3’5’H、PhF3’5’H-1、PhF3’5’H-2 真核表达质粒的构建  38-39
    4.4.2 酶活测定  39-44
  4.5 异源模式植物表达  44-46
    4.5.1 CsF3’5’H 异源植物表达质粒构建  44
    4.5.2 异源表达载体侵染烟草  44
    4.5.3 转基因烟草粗酶活性检测  44-46
  4.6 茶树体内 B 环羟基化基因的体外酶活证据及表达特异性分析  46-50
5 讨论  50-52
  5.1 CSF3’5’H 的原核表达  50
  5.2 CSF3’5’H 的真核表达、异源植物表达与体外酶活测定  50-51
  5.3 类黄酮 B 环羟基化相关的功能基因的表达差异  51-52
6 结论  52-53
参考文献  53-57
附录英文缩写及注释  57-59
致谢  59-60
作者简介  60

茶树类黄酮3’，5’-羟基化酶的基因克隆与功能研究

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