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结核杆菌ESAT6基因密码子优化真核载体的构建及其免疫效应的研究

作　者: 王英
导　师: 王雪梅
学　校:
专　业: 病原生物学
关键词: 结核分枝杆菌 ESAT6 密码子优化重组质粒免疫效应
分类号: R378.911
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：（1）构建结核杆菌ESAT6基因密码子优化核酸疫苗pVAX1-ESAT6-O和ESAT6天然密码子核酸疫苗pVAX1-ESAT6。（2）原核表达ESAT6重组蛋白。（3）评价ESAT6基因密码子优化核酸疫苗pVAX1-ESAT6-O和天然密码子核酸疫苗pVAX1-ESAT6的免疫效应。方法：（1）培养结核分枝杆菌H37Ra菌株。（2）从结核杆菌H37Ra菌株中提取DNA，设计引物，以此DNA为模板通过PCR技术扩增ESAT6基因。（3）ESAT6基因与pET42a（+）载体双酶切后的纯化产物在T4连接酶的作用下连接，构建原核表达质粒pET42a(+)-ESAT6，经菌落PCR、单双酶切及DNA测序鉴定重组质粒是否正确；鉴定正确的阳性菌株，转化至大肠埃希菌BL21（DE3+）中,经IPTG诱导表达重组蛋白，采用GST和镍柱亲和层析纯化重组蛋白，通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行分析和鉴定，大量纯化蛋白,去除内毒素并用鲎试剂定性检测内毒素，便于后续试验。（4）酶切纯化的ESAT6基因和pVAX1空质粒经T4连接酶连接构建真核表达质粒pVAX1-ESAT6，经菌落PCR、单双酶切及DNA测序鉴定重组质粒是否正确。（5）按照哺乳动物密码子使用偏好，对结核分枝杆菌ESAT6基因进行优化，使用GeneOptimizer软件对ESAT6基因的氨基酸编码基因进行优化，但不改变氨基酸序列。优化后的基因序列，由南京金斯瑞生物公司合成，并插入pVAX1质粒。（6）分别大量提取pVAX1-ESAT6-O、pVAX1-ESAT6和pVAX1。首先，体外转染Hela细胞，并通过RT-PCR、间接免疫荧光检测其在真核细胞内的表达；其次，经肌肉注射并电转染免疫小鼠，免疫组化观察小鼠骨骼肌瞬时表达效果。(7) pVAX1-ESAT6-O、pVAX1-ESAT6和pVAX1肌肉注射并电转染免疫BALB/c小鼠，3次重复免疫后，取脾脏制备小鼠脾淋巴细胞经ESAT6抗原刺激培养后，以流式细胞技术检测淋巴细胞增殖水平和以ELISPOT检测分泌IFN-γ的特异性细胞免疫情况，并以间接ELISA法检测免疫后血清中IFN-γ的水平和相应的特异性抗体及特异性抗体动态变化等免疫指标。结果：(1)构建的了pET42a(+)-ESAT6重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果与预期结果一致，DNA测序鉴定结果经BLAST比对与标准株H37Ra基因组序列及标准株H37Rv的ESAT6基因序列完全一致。pET42a(+)-ESAT6阳性菌经IPTG诱导后，蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中大量表达，经SDS-PAGE分析为可溶性表达，表达量占菌体蛋白的30.5%。Western blot显示重组蛋白能与ESAT6单克隆抗体发生特异性免疫结合反应，经ToxinEraserT M去内毒素试剂盒进行去除内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性。（2）构建的ESAT6天然密码子核酸疫苗pVAX1-ESAT6重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果与预期结果一致，DNA测序结果经BLAST比对插入基因序列与标准H37Rv株基因序列完全一致。（3）获得了结核分枝杆菌ESAT6优化后的ESAT6基因序列，并全基因合成，构建的ESAT6基因密码子重组质粒pVAX1-ESAT6-O经PCR和双酶切鉴定结果与预期结果一致，DNA测序结果经BLAST比对插入基因序列与设计的ESAT6优化密码子序列基因序列完全一致。（4）pVAX1-ESAT6-O和pVAX1-ESAT6重组质粒真核细胞转染后RT-PCR结果显示实验组均有相应的mRNA表达，间接免疫荧光检测表明目的基因能在Hela细胞中表达蛋白，免疫组化检测结果发现空白对照和空质粒组着色不明显，转染了重组质粒的小鼠骨骼肌纤维内均有着色显著的棕黄色阳性颗粒。（5）免疫后各组小鼠淋巴细胞增殖实验结果显示pVAX1-ESAT6-O组和pVAX1-ESAT6组PI值显著高于pVAX1组和NS组(p＜0.01），pVAX1-ESAT6-O组显著高于pVAX1-ESAT6组(p＜0.05），pVAX1组和NS组无显著性差异（p＞0.05）。ELISPOT检测结果显示pVAX1-ESAT6-O组和pVAX1-ESAT6组经抗原刺激后分泌IFN-γ的淋巴细胞数与pVAX1组和NS组相比有显著性差异（p＜0.01），pVAX1-ESAT6-O组与pVAX1-ESAT6组相比有显著性差异(p＜0.05）。ELISA检测免疫后小鼠血清中分泌IFN-γ的水平与ELISPOT实验结果趋势一致。免疫后pVAX1-ESAT6-O组和pVAX1-ESAT6组小鼠血清中特异性IgG抗体水平随着免疫次数的增加而明显增高，pVAX1组和NS组则未出现此现象，而且pVAX1-ESAT6-O组和pVAX1-ESAT6组特异性抗体水平显著高于pVAX1组和NS组(p＜0.01），pVAX1-ESAT6-O组高于pVAX1-ESAT6组(p＜0.05），pVAX1组和NS组无显著性差异（p＞0.05）。结论：（1）成功构建了原核表达载体pET42a(+)-ESAT6，并且在E.coli BL21(DE3)工程菌中高效表达ESAT6蛋白。（2）成功构建了真核表达载体pVAX1-ESAT6-O和pVAX1-ESAT6，初步揭示了其均可在体内外表达，可诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫，并且pVAX1-ESAT6-O诱导的免疫效应明显高于pVAX1-ESAT6。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-11
前言  11-14
材料与方法  14-37
结果  37-51
讨论  51-56
结论  56-57
参考文献  57-64
致谢  64-65
附录 A 英中文术语缩略语对照表  65-66
附录 B 常用试剂配制  66-70
附录 C 个人简历与发表的论文  70-71
附录 D 综述  71-82
  参考文献  77-82

结核杆菌ESAT6基因密码子优化真核载体的构建及其免疫效应的研究

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