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重组牛乳铁蛋白N-叶毕赤酵母的构建与表达研究

作　者: 朱艳萍
导　师: 王建华
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 牛乳铁蛋白N-叶密码子优化巴斯德毕赤酵母表达铁结合活性抗菌活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf)是哺乳动物乳汁中含量丰富的一种铁结合糖蛋白,目前已发现乳铁蛋白及其水解产物具有广谱抗菌,抗氧化,抗病毒,调节免疫反应,促进铁吸收等多种生理功能,是哺乳动物体内非特异性免疫防御系统的重要组成成分之一。本实验通过基因工程手段,构建真核重组表达载体,实现牛乳铁蛋白N-叶(1-333个氨基酸)在巴斯德毕赤酵母中的异源表达,并对其功能活性进行测定。采用实验室规模5L发酵罐水平进行发酵小试,为深入研究乳铁蛋白的结构和功能,进一步实现规模化工业生产提供实践基础和理论指导。本实验人工合成密码子优化改造的牛乳铁蛋白N-叶基因序列,在不改变氨基酸编码序列前提下,在充分考虑GC含量,起始密码子处的二级结构及自由能的基础上选择巴斯德毕赤酵母偏爱密码子,并消除mRNA降解信号和内部转录终止序列,去掉N-叶自身的信号肽编码序列,利用pPIC9K所携带的α信号肽进行分泌表达。优化后共改变253个碱基,C+G含量由56.39%降至40.42%;起始密码子附近mRNA二级结构减少,自由能明显降低,有利于维持mRNA的稳定性,促进翻译顺利进行,有助于提高目的蛋白表达量。进一步构建了牛乳铁蛋白N-叶毕赤酵母表达载体pPICPK-BLfN-6His,Pme I线性化后电转化入毕赤酵母GS115中,在0.5%甲醇条件下摇瓶水平诱导表达,Endo H对发酵液上清进行去糖基化处理,SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白得到表达并进行了糖基化修饰,其分子量约为38 kDa,并在摇瓶水平进行pH和溶氧条件优化。将摇瓶水平筛选到的高表达量重组子进行实验室规模5L发酵罐水平高密度发酵,在优化碳源,pH,补料添加策略的基础上,诱导96h后,发酵液上清中总蛋白量达到540.07 mg/L。采用His-bind镍柱亲和层析分离纯化目的蛋白,并对其铁结合功能和抑菌功能进行实验测定。rBLfN具有pH依赖性的Fe3+释放能力,随着pH下降,与铁结合能力逐渐降低。体外抑制Staphylococcus aureus ATCC 25923,与阴性对照1.12×107 CFUs/ml相比,浓度为6 mg/ml和3 mg/ml rBLfN对Staphylococcus aureus ATCC 25923的(生长有抑制作用,)MIC分别为0.68×107 CFUs/ml和0.92×107 CFUs/ml。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章引言  13-26
  1.1 乳铁蛋白概述  13-24
    1.1.1 乳铁蛋白的发现与分布  13-14
    1.1.2 乳铁蛋白的分子结构  14-16
    1.1.3 乳铁蛋白的理化性质  16-17
    1.1.4 乳铁蛋白的生物学功能  17-22
    1.1.5 乳铁蛋白应用及国内外研究现状  22-24
  1.2 本研究目的及意义  24
  1.3 本研究立题依据  24-26
第二章牛乳铁蛋白N-叶结构的生物信息学分析  26-36
  2.1 牛乳铁蛋白N-叶生物信息学分析  26-29
    2.1.1 生物信息学软件模拟牛乳铁蛋白N-叶(1-333AA)空间三维结构  26
    2.1.2 预测牛乳铁蛋白N-叶表面电荷分布  26-27
    2.1.3 牛乳铁蛋白N-叶二级结构预测  27-28
    2.1.4 牛乳铁蛋白N-叶跨膜区预测  28
    2.1.5 牛乳铁蛋白N-叶糖基化位点预测  28-29
  2.2 密码子优化牛乳铁蛋白N-叶基因  29-34
    2.2.1 牛乳铁蛋白N-叶基因密码子优化分析  29
    2.2.2 根据密码子优化原则对N-叶基因进行优化改造  29-32
    2.2.3 对牛乳铁蛋白N-叶基因编码氨基酸序列进行分析  32-34
    2.2.4 牛乳铁蛋白N-叶起始密码子AUG 附近二级结构自由能分析  34
  2.3 讨论  34-36
    2.3.1 牛乳铁蛋白N-叶结构分析  34-35
    2.3.2 密码子优化改造牛乳铁蛋白N-叶基因  35-36
第三章牛乳铁蛋白 N-叶基因在 P.pastoris GS115 中表达  36-66
  3.1 实验材料  36-39
    3.1.1 质粒与菌株  36
    3.1.2 工具酶及其它试剂  36-37
    3.1.3 培养基及缓冲液的配制  37-38
    3.1.4 主要仪器设备  38-39
    3.1.5 合成引物及DNA 测序  39
  3.2 实验方法  39-50
    3.2.1 PCR 引物合成  39
    3.2.2 PCR 扩增目的基因  39-40
    3.2.3 重组表达载体的构建  40-41
    3.2.4 重组质粒转化Escherichia coli DH5α  41
    3.2.5 菌落PCR 筛选E.coli DH5α重组转化子  41-42
    3.2.6 重组表达质粒电转化酵母与酵母重组子筛选  42-43
    3.2.7 重组酵母摇瓶水平发酵  43-44
    3.2.8 重组酵母摇瓶水平上培养基pH 条件的优化  44
    3.2.9 共表达透明颤菌血红蛋白基因vgb 优化溶氧条件  44-47
    3.2.10 重组酵母5 L 发酵罐水平高密度发酵  47-48
    3.2.11 rBLfN 去糖基化分析及Western Blot 检测  48-49
    3.2.12 His-bind 镍柱纯化rBLfN  49
    3.2.13 rBLfN 铁结合活性分析  49-50
    3.2.14 rBLfN 抑菌活性检测  50
  3.3 实验结果  50-60
    3.3.1 重组表达载体的构建  50-51
    3.3.2 大肠杆菌菌落PCR 筛选阳性转化子  51-52
    3.3.3 酵母重组子的构建及菌落PCR 筛选阳性重组子  52
    3.3.4 酵母重组子摇瓶水平表达  52-53
    3.3.5 重组酵母摇瓶水平pH 条件优化  53-54
    3.3.6 共表达透明颤菌血红蛋白基因vgb 优化溶氧条件  54-56
    3.3.7 酵母重组子5 L 发酵罐水平高密度发酵  56-58
    3.3.8 去糖基化及Western Blot 检测rBLfN  58
    3.3.9 His-bind 镍柱纯化rBLfN  58-59
    3.3.10 rBLfN 铁结合活性分析  59-60
    3.3.11 rBLfN 抑菌活性检测  60
  3.4 讨论  60-66
    3.4.1 表达系统的选择  60-61
    3.4.2 基因密码子优化改造及其表达  61-62
    3.4.3 高密度发酵的优势  62-63
    3.4.4 乳铁蛋白N-叶功能  63
    3.4.5 基因高效表达策略研究  63-66
第四章结论  66-67
参考文献  67-74
致谢  74-75
作者简历  75

重组牛乳铁蛋白N-叶毕赤酵母的构建与表达研究

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