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牛朊蛋白基因PrP102-242和PrP1-264在COS-7细胞中的表达

作　者: 丁耀忠
导　师: 殷宏；曾巧英
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 重组质粒 细胞巨化病毒 COS 基因突变 真核表达载体 重组蛋白 PrP1-264 PrP102-242 双酶切 朊蛋白 Western PrPC 片段 间接免疫荧光 外源基因 脂质体介导 编码基因 PrPSc 克隆载体 表达系统
分类号: S852.659.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


【目的】朊病毒(Scrapie Prion Protein, PrPSc)是疯牛病等海绵状脑病的致病因子。PrPSc是由正常的细胞型朊蛋白(Cellular Prion Protein, PrPC)通过空间构象转变产生的,PrP27-30是PrPSc的具有感染性的核心片段。PrPC由一个正常的内源性基因Prnp编码,充分了解PrPC的结构与功能有助于揭示PrPSc的致病机制。尽管PrPC在脑组织内富集,但是不易提取,限制了研究。为了克服这一难题,采取哺乳动物细胞表达系统表达出具有天然构象的PrP是当前研究PrPC的有效手段。本研究旨在实现两种牛朊蛋白编码基因PrP102-242(成熟的PrP,编码PrP27-30)和PrP1-264(由成熟的PrP、N端信号肽和C端GPI锚构成)在COS-7细胞中的表达,以期为牛PrPC的结构与功能研究以及免疫学诊断奠定物质基础。【方法】利用PCR技术从连有目的片段的克隆载体上扩增PrP102-241和PrP1-264的编码序列,并用EcoRⅠ和SalⅠ分别对两个目的片段和pCI-neo载体进行双酶切,连接转化,并利用PCR、双酶切初步鉴定后,通过序列测定证明获得阳性重组质粒。利用脂质体介导方法将两个阳性重组质粒分别导入COS-7细胞后,依次用浓度为100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL和400ug/mL的G418加压筛选,获得稳定表达的阳性细胞株。RT-PCR检测外源基因转录水平,然后用抗PrP特异性单克隆抗体(7B6/D2)作为检测探针,分别用间接免疫荧光、间接ELISA和Western-blot检测两个不同长度的PrP基因在COS-7细胞内的转录水平和表达水平。【结果】PCR、双酶切以及测序的结果表明,牛PrP102-242和PrP1-264的编码基因被正确插入真核表达载体pCI-neo,构建的重组质粒分别被命名为pCIneo-PrP102-242和pCIneo-PrP1-264。脂质体介导的两个重组质粒转染COS-7细胞后,经4个浓度的G418加压筛选和亚克隆后,获得了两株的抗性细胞株,分别被命名为7B2和30C1。RT-PCR检测表明两个重组质粒所携带的外源基因被整合到宿主细胞基因组中并可以正常转录。用抗PrP的特异性单克隆抗体(7B6/D2)作为检测探针,间接免疫荧光检测表明已经整合到宿主细胞基因组中的外源基因可表达。间接ELISA检测结果表明2陪稀释的阳性细胞株7B2和30C1细胞裂解液ELISA值分别达到1.095和1.259。筛选药物G418在100ug/mL到400ug/mL范围内,7B2和30C1表达水平呈正相关当G418在100ug/mL至400ug/mL范围时,细胞株7B2和30C1表达水平与G418的浓度呈正相关。SDS-PAGE和Western-blot分析表明7B2和30C1表达分子量分别为18.0kD和35.0kD,并能与PrP单抗(7B6/D2)发生特异反应。【结论】本研究成功构建两个两个不同长度的牛PrP基因的真核表达载体PCI-PrP102-242和PCI-PrP1-264;经G418加压筛选获得了两株表达量较高的抗性细胞株7B2和30C1,其中细胞株7B2可表达重组蛋白PrP102-242,细胞株30C1可表达重组蛋白PrP1-264。间接免疫荧光、间接ELISA和Western-blot检测表明所筛选的7B2、30C1均能与PrP单抗(7B6/D2)反生特异性反应。

全文目录


摘要  3-5
Summary  5-11
英文缩略表  11-12
第一章 文献综述  12-21
  1.1 疯牛病定义及海绵状脑病的特征  12
  1.2 海绵状脑病的致病原  12-17
    1.2.1 PrPC 和PrPSc 的基本特征  13-15
    1.2.2 PrPC 的生理功能  15-17
  1.3 朊蛋白的制备  17-19
    1.3.1 E.coli 原核表达系统  17-18
    1.3.2 真核表达系统  18-19
  1.4 表达载体  19-20
    1.4.1 启动子是影响外源基因表达效率的关键因素  19
    1.4.2 多聚腺苷酸加尾信号  19
    1.4.3 插入序列（IVS）  19
    1.4.4 Kozak 序列对表达的影响  19-20
  1.5 本研究的目的  20-21
第二章 PrP102-242 在COS-7 细胞中的表达及检测  21-33
  1 前言  21
  2 材料和方法  21-28
    2.1 材料  21-22
      2.1.1 菌株、载体和细胞株  21
      2.1.2 主要试剂和工具酶  21-22
      2.1.3 仪器与设备  22
      2.1.4 培养基  22
      2.1.5 常规溶液和缓冲液  22
    2.2 方法  22-25
      2.2.1 PCR 引物设计和扩增  22-23
      2.2.2 PCR 产物的纯化  23
      2.2.3 纯化PCR 产物的双酶切和PCR 清洁  23-24
      2.2.4 pCI-neo 载体质粒的提取  24
      2.2.5 pCI-neo 载体质粒的双酶切  24
      2.2.6 目的DNA 片段与pCI-neo 的连接  24
      2.2.7 连接产物的转化  24
      2.2.8 重组质粒的提取与鉴定  24-25
      2.2.9 重组质粒pCIneo-PrP102-242 双酶切鉴定  25
      2.2.10 重组质粒的测序和序列分析  25
    2.3 细胞转染及阳性细胞克隆的筛选  25-26
      2.3.1 脂质体转染及RT-PCR 检测  25-26
      2.3.2 阳性细胞克隆的筛选  26
    2.4 表达蛋白的检测  26-28
      2.4.1 间接免疫荧光检测目的蛋白  26-27
      2.4.2 间接ELISA 检测细胞上清中蛋白表达  27
      2.4.3 间接ELISA 检测细胞中蛋白的表达  27
      2.4.4 Western blot 检测细胞中蛋白的表达  27-28
  3 结果  28-32
    3.1 重组表达载体构建  28-29
      3.1.1 PCR 结果鉴定  28
      3.1.2 PrP 基因的克隆和真核表达载体的构建  28-29
    3.2 细胞转染及阳性细胞克隆的筛选  29-30
      3.2.1 RT-PCR 检测转染  29
      3.2.2 阳性细胞克隆的筛选  29-30
    3.3 检测结果  30-32
      3.3.1 间接免疫荧光检测  30
      3.3.2 间接ELISA 检测细胞上清  30-31
      3.3.3 间接ELISSA 检测细胞中蛋白  31
      3.3.4 Western blot 检测结果  31-32
  4 讨论  32-33
第三章 PrP1-264 在COS-7 中的表达及生物活性检测  33-41
  1 前言  33
  2 材料和方法  33-35
    2.1 材料  33
      2.1.1 菌株、载体，细胞、试剂以及酶  33
      2.1.2 PCR 引物设计  33
    2.2 方法  33-35
      2.2.1 表达载体的构建  33-35
      2.2.2 细胞转染及阳性细胞克隆的筛选  35
  3 表达蛋白的检测  35-36
    3.1 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达  35
    3.2 间接ELISA 检测细胞中蛋白的表达  35
    3.3 Western blot 检测  35-36
  4 结果  36-39
    4.1 重组表达载体构建结果  36-37
      4.1.1 PCR 结果鉴定  36
      4.1.2 PrP 基因的克隆和真核表达载体的构建  36-37
    4.2 细胞转染及阳性细胞克隆的筛选鉴定  37
      4.2.1 RT-PCR 检测转染  37
      4.2.2 阳性细胞克隆的筛选  37
    4.3 检测结果  37-39
      4.3.1 间接免疫荧光检测结果  37-38
      4.3.2 间接ELISSA 检测细胞中蛋白结果  38
      4.3.3 Western blot 检测结果  38-39
  5 讨论  39-41
第四章 结论  41-42
参考文献  42-47
致谢  47-48
作者简介  48-50
导师简介  50-51

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学 > 朊病毒
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