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比较研究过表达抗原Ag85A或Ag85B的重组卡介苗菌株的保护性

作　者: 王春
导　师: 范雄林
学　校: 华中科技大学
专　业: 病原生物学
关键词: 疫苗 Ag85A Ag85B 结核分枝杆菌重组卡介苗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景疫苗是结核病(Tuberculosis,TB)预防策略中重要的医学干预手段,卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)是目前世界上唯一被广泛使用的预防结核疫苗,鉴于BCG对成人结核病保护效力的不稳定,发展更好的抗结核疫苗成为迫切的需要。重组卡介苗(rBCG)是一种很有前景的抗结核候选疫苗研制策略。抗原Ag85A和Ag85B均具有较强的免疫原性,并且是较有希望的结核病疫苗靶抗原;我们在前期的工作中发现,编码抗原Ag85A和Ag85B的基因疫苗免疫小鼠,可以刺激产生不同的免疫保护效应。为了深入分析重组卡介苗的长期保护性和细胞免疫(CMI)的关系,在本课题的研究中,我们进一步建立了分别过表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)免疫优势抗原Ag85A或Ag85B的两种重组卡介苗( rBCG::85A和rBCG::85B)菌株,并在小鼠体内比较研究了两种重组疫苗的保护性,为阐明重组卡介苗长期保护性的细胞免疫机制奠定基础。目的1.建立重组卡介苗( rBCG::85A和rBCG::85B)菌株;2.观察rBCG诱导的免疫反应;3.探讨rBCG对小鼠结核模型的保护性与免疫保护机制。方法1.构建表达Ag85A或Ag85B蛋白的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV85A, pMV85B;重组质粒以及pMV261电穿法构建重组卡介苗;Western blotting方法分析蛋白在rBCG中的表达;2. rBCG::85A和rBCG::85B免疫C57BL/6小鼠,以ELISA,FACS,ELISPOT等方法观察特异性体液免疫和细胞免疫的产生;3. rBCG::85A和rBCG::85B免疫BALB/c和C57BL/6小鼠,对免疫后小鼠进行H37Rv毒株攻击实验,不同时间点测定组织荷菌量、组织病理学改变等指标评价疫苗的保护性。结果1.成功构建rBCG::85A和rBCG::85B;通过Western blotting方法对其菌体裂解上清和培养上清中蛋白的表达进行鉴定,发现,Ag85A蛋白作为一种分泌蛋白,主要表达于rBCG::85A菌株培养上清中,Ag85B蛋白主要存在于rBCG::85B菌株的培养上清中;2. rBCG免疫C57BL/6小鼠后,能够诱导特异性体液和细胞免疫的产生。ELISA结果显示免疫小鼠可以产生高滴度的特异性抗体;IFN-γELISPOT实验示免疫组小鼠第6,24周,特异性蛋白刺激rBCG::85B和rBCG::85A组脾细胞,均产生较高的抗原特异的IFN-γ分泌细胞;FACS示肺脏CD4+/CD8+T细胞比例在rBCG::85B组增加,在rBCG::85A实验组减少;脾脏正好相反。3.组织荷菌量显示攻击后4周,相比rBCG::261组,rBCG::85A和rBCG::85B组均可以明显降低小鼠肺脏和脾脏载菌量,攻击后18周,相比rBCG::85A组,rBCG::85B组降低肺脏载菌量更加显著;肺脏组织病理学检查结果示攻击后18周,rBCG均可以提供比BCG更强的保护性。结论1.分别过表达结核分枝杆菌免疫优势抗原Ag85A和Ag85B的菌株重组卡介苗rBCG::85A和rBCG::85B;与原始卡介苗相比,这两种重组卡介苗均能够诱导较长期的保护性,rBCG::85B能够诱导更强的保护性。2.我们的结果显示,重组卡介苗诱导的长期保护性跟抗原特异性IFN-γ相关,并且肺脏早期的CD4+T细胞的应答有可能与其更持久的保护性相关。

全文目录

英文缩写词表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-13
材料和方法  13-38
  一实验材料  13-23
  二实验方法  23-38
结果  38-46
  一重组卡介苗的构建和蛋白表达  38-39
  二重组卡介苗诱导的特异性抗体反应  39-40
  三 IFN-γELISPOT 实验  40-41
  四脾脏和肺脏T 淋巴细胞亚群的分析  41-43
  五重组卡介苗的保护效率分析  43-44
  六组织病理学检查  44-46
讨论  46-49
References  49-53
综述  53-61
  参考文献  58-61
附录  61-62
致谢  62

比较研究过表达抗原Ag85A或Ag85B的重组卡介苗菌株的保护性

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