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解脂耶氏酵母脂肪酶Lip1基因的密码子优化及功能表达

作　者: 张黎
导　师: 闫云君
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 解脂耶氏酵母脂肪酶密码子优化 GAP启动子诱导型表达组成型表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脂肪酶（Lipase,EC 3.1.1.3）即三酰甘油酯酰基水解酶,广泛存在于各种动植物和微生物中,是一类具有多种催化能力的酶,可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、酯化、醇解、酯交换以及酯类的逆向合成反应等。广泛应用于油脂加工、食品、纺织、医药、日化、皮革脱脂、洗涤以及生物传感器等行业,受到广泛的关注。但目前脂肪酶成本较高,因而开发高效、低成本的脂肪酶成为研究的焦点。本论文以解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为出发菌株,根据NCBI中报道的脂肪酶家族基因序列,扩增其脂肪酶基因,并首次实现脂肪酶基因lip1在巴斯德毕赤酵母GS115（Pichia pastoris）中的功能性表达。具体工作和研究结果如下:1.根据GeneBank中已经提交的Y. lipolytica脂肪酶家族基因序列,运用生物信息学设计引物,以Y. lipolytica基因组DNA为模板,扩增脂肪酶基因lip1-lip8,其中除lip2、lip7、lip8之外的其它脂肪酶基因的表达,到目前为止均未见文献报道。本论文首次实现了脂肪酶基因lip1在P. pastoris GS115中的功能性表达,丰富了脂肪酶基因资源。2.由于P. pastoris表达系统存在密码子偏好性,而脂肪酶基因lip1中含有P. pastoris低频率使用密码子,因而运用重叠延伸PCR（Overlap extension PCR）技术对Lip1的8个氨基酸位点进行优化,改造成为P. pastoris偏爱性密码子,实现了Lip1的高效表达。根据生物信息学预测,Lip1不含有信号肽,是一种细胞内表达脂肪酶。因此,本论文构建了含有GAP强启动子的组成型表达载体pGAP9K,使Lip1实现胞外分泌表达,为进一步研究该脂肪酶的性质奠定技术基础。3.将原始脂肪酶基因lip1以及经密码子优化后的基因Mlip1分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pGAP9K上,构建了4个表达质粒:pPIC9K-lip1、pPIC9K-Mlip1、pGAP9K-lip1和pGAP9K-Mlip1,表达载体电转至P.pastoris GS115中进行功能性表达,发酵测酶活,结果表明:密码子优化后基因表达水平相对于出发基因有较大提高,且优化后组成型表达水解酶活达8.07 U/mL,明显优于诱导型表达。同时,通过SDS-PAGE电泳验证脂肪酶分子量大小,在53 kDa处有一特异条带。对酵母工程菌GS115-pGAP9K-Mlip1发酵条件进行初步优化,确定其最优发酵培养基,优化结果为最适YP（酵母膏+蛋白胨）含量为3（YP）,最适碳源为油酸。4.对Lip1酶学性质进行了初步研究,结果表明:Lip1对短链的对硝基苯酚酯有较强的水解活性,其最适底物为pNPB（C4）,最适pH为8.5,最适温度为45℃。在60℃的恒温水浴条件下温浴2 h后残余酶活为35.88%;金属离子对脂肪酶Lip1活力影响实验表明,Mg²⁺、Fe²⁺和Zn²⁺对其活力有一定的激活作用,而Cu²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺和EDTA则抑制其水解酶活力。此外,运用生物信息学预测和分析脂肪酶Lip1的一级结构,二级结构和三级结构,为下一步对Lip1进行蛋白质纯化及结构生物学研究奠定了技术基础。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
1 绪论  10-33
  1.1 脂肪酶概述  10-18
  1.2 解脂耶氏酵母脂肪酶  18-23
  1.3 密码子优化  23-25
  1.4 毕赤酵母表达系统  25-31
  1.5 本课题的目的和意义  31-33
2 解脂耶氏酵母 lip1 密码子优化及组成型表达载体构建  33-56
  2.1 实验材料  33-37
  2.2 实验方法  37-50
  2.3 结果与分析  50-55
  2.4 讨论  55-56
3 重组子诱导型和组成型表达及发酵条件优化  56-75
  3.1 实验材料  56-59
  3.2 实验方法  59-68
  3.3 结果与分析  68-73
  3.4 讨论  73-75
4 Lip1 酶学性质研究及结构预测  75-86
  4.1 实验材料  75
  4.2 实验方法  75-76
  4.3 结果与分析  76-84
  4.4 讨论  84-86
5 小结与展望  86-88
  5.1 小结  86-87
  5.2 展望  87-88
致谢  88-89
参考文献  89-99
附录1 硕士期间发表论文  99-100
附录2 基因序列  100-101

解脂耶氏酵母脂肪酶Lip1基因的密码子优化及功能表达

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