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基于实时荧光定量PCR的植物转基因检测技术的改进与应用

作　者: 王伟伟
导　师: 徐昌杰
学　校: 浙江大学
专　业: 果树学
关键词: Micro-Tom番茄 金柑 DNA快速制备 实时荧光定量PCR 转基因检测 重组质粒构建 拷贝数鉴定
分类号: S641.2;S666
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


转基因检测是转基因研究的必要环节。本研究以Micro-Tom番茄和金柑为试材,建立了快速提取DNA用于实时定量PCR检测转基因植株和构建重组质粒筛选最佳引物体系,并应用质粒添加实时定量PCR法对转基因金柑的拷贝数进行了验证。主要研究结果如下：(1)适于实时PCR检测转基因的DNA快速制备技术以番茄叶片为试材,建立了一种简便快速制备叶片基因组DNA的方法。利用煮沸法提取番茄叶片,可以在30 min内完成12个样品的DNA制备。同时确定叶片面积大小从2 mm2至50mm2,在12.5μL的PCR体系中添加0.1μL-0.2μL的DNA模板,均可实现扩增。结果表明,建立的实时定量PCR体系能够准确的检测转基因植株,根据目标基因HPT和内标基因ELIP的Ct差值(ΔCt),应用2(1-ΔCt)可以判断目标基因是否插入。(2)重组质粒的构建及最佳引物对的筛选利用分子生物学技术在番茄中构建了包含目标基因HPT和番茄内标基因ELIP的重组质粒HPT-ELIP,并应用10000 copy·μL-1的浓度筛选出适合实时定量PCR的最佳引物对P438+P439和SP061+SP062。同时在金柑中构建了包含目标基因NPTII和金柑内标基因CS的重组质粒CS-NPTII,同时应用10000copy·μL-1的浓度筛选出实时定量PCR的最佳引物对CS001+CS002和SP069+SP070,用于下一步准确鉴定转基因金柑拷贝数。(3)建立了质粒添加实时定量PCR法鉴定转基因植株拷贝数体系利用构建的重组质粒筛选出来的最佳实时定量PCR引物对,以筛选标记基因NPTII和金柑内标基因CS为检测对象,利用质粒添加实时定量PCR法鉴定转基因拷贝数。结果表明,所建立的质粒添加实时定量PCR法鉴定转基因金柑的拷贝数和Southern杂交分析结果一致。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略词  9-10
目录  10-13
第一章 文献综述  13-20
  1 转基因植物研究进展  13
  2 转基因植株早期检测技术  13-16
    2.1 PCR法  14
    2.2 多重PCR法  14-15
    2.3 实时荧光定量PCR法  15-16
  3 实时荧光定量PCR在转基因检测中的应用  16-19
    3.1 实时荧光定量PCR在转基因拷贝数鉴定中的应用  16-17
    3.2 实时荧光定量PCR在转基因产品检测中的应用  17-19
  4 研究意义和内容  19-20
    4.1 研究意义  19
    4.2 研究内容  19-20
第二章 快速提取DNA用于实时定量PCR检测转基因  20-29
  1 材料与方法  21-23
    1.1 材料  21
      1.1.1 植物材料  21
      1.1.2 引物  21
      1.1.3 主要试剂  21
    1.2 方法  21-23
      1.2.1 DNA制备  21-22
      1.2.2 实时荧光定量PCR  22
      1.2.3 PCR产物电泳  22-23
  2 结果与分析  23-27
    2.1 DNA的快速制备方法  23
    2.2 DNA模板体积对实时荧光定量PCR的影响  23-25
    2.3 不同叶片用量对实时荧光定量PCR的影响  25-26
    2.4 DNA快速制备及相适应的实时PCR体系在转基因检测中的应用  26-27
  3 讨论  27-29
第三章 番茄重组质粒的构建及最佳引物对的筛选  29-38
  1 材料与方法  29-34
    1.1 材料  29-31
      1.1.1 植物材料  29
      1.1.2 引物  29-30
      1.1.3 主要试剂  30-31
    1.2 方法  31-33
      1.2.1 基因组DNA的微量提取(CTAB法)  31
      1.2.2 PCR扩增目的片段  31
      1.2.3 PCR产物的克隆  31-32
      1.2.4 包含番茄ELIP基因和HPT基因的重组质粒的构建  32-33
    1.3 最佳引物对的筛选  33-34
      1.3.1 重组质粒HE的提取和纯化  33
      1.3.2 重组质粒拷贝数的确定  33
      1.3.3 实时荧光定量PCR确定最佳引物对  33-34
  2 结果与分析  34-37
    2.1 ELIP基因和HPT基因的分离及克隆  34
    2.2 包含ELIP基因与HPT基因的重组质粒的构建  34-35
    2.3 重组质粒拷贝数的确定  35-36
    2.4 实时PCR最佳引物对的确定  36-37
  3 讨论  37-38
第四章 质粒添加实时PCR法验证转基因金柑拷贝数  38-47
  1 材料与方法  38-41
    1.1 材料  38-39
      1.1.1 转基因植物材料  38
      1.1.2 引物  38-39
      1.1.3 主要试剂  39
    1.2 方法  39-41
      1.2.1 柠檬酸合酶基因citrate synthase(CS)的分离  39
      1.2.2 植物表达载体pBI121的构建、测序及结果分析  39-40
      1.2.3 实时PCR最佳引物对的筛选  40
      1.2.4 质粒添加实时定量PCR法的反应体系及程序  40
      1.2.5 拷贝数的计算  40-41
  2 结果与分析  41-45
    2.1 柠檬酸合酶基因的分离及克隆  41-42
    2.2 包含柠檬酸合酶基因(CS)与NPTⅡ基因的重组质粒的构建  42
    2.3 实时定量PCR最佳引物对的确定  42-43
    2.4 转基因金柑拷贝数计算  43-45
  3 讨论  45-47
结语  47-48
参考文献  48-53

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类
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