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结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT6与rdESAT6在毕赤酵母中的克隆表达及其在结核早期诊断中的应用

作　者: 孙晓璐
导　师: 汪成富；李忠明
学　校: 苏州大学
专　业: 微生物
关键词: 毕赤酵母 ESAT6 rdESAT6 酶联免疫斑点实验
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

ESAT6(6kD early secreted antigenic target),即早期分泌抗原靶,存在于结核分枝杆菌(MTB,Mycobacterium tuberculosis)的早期培养滤液中,是一种小分子量的分泌蛋白,因为其仅存在于MTB等致病性分枝杆菌而卡介苗(BCG)等非致病性分枝杆菌缺乏,并且能够有效的诱导细胞免疫反应,所以可以作为结核病早期诊断的特异性抗原之一。rdESAT6(recombinant dimer ESAT6)为ESAT6的重组二聚体,因为其具有更多的反应表位,所以表现出更强的抗原性。现有的大肠杆菌(E.coli)与耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)表达系统,只能得到包涵体形式的rdESAT6蛋白,在提纯过程中需经过变性与复性过程,操作复杂且不利于临床应用。本文采用毕赤酵母分泌型表达系统,得到可溶性的具有接近天然结构形态的rdESAT6抗原。目的:构建毕赤酵母表达系统,表达结核分枝杆菌分泌性抗原ESAT6与rdESAT6,得到可溶性的具有接近天然结构的蛋白抗原,并研究其作为抗原刺激物在结核病早期诊断中的应用。方法:用PCR技术扩增结核分枝杆菌抗原基因esat6及rdesat6,分别克隆到pPic9k载体中,通过电转化重组到毕赤酵母基因组并进行表达。采用镍柱(Ni-NTA)纯化目的蛋白。取重组BCG免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞,以大肠杆菌、耻垢分枝杆菌与毕赤酵母表达的同一抗原rdESAT6分别为抗原刺激物进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT),并分析其刺激细胞产生γ-干扰素(IFN-γ)的能力。结果:采用毕赤酵母真核表达系统成功表达了ESAT6与rdESAT6蛋白抗原,ESAT6的产量低且难以纯化,以Ni-NTA亲和层析成功纯化得到高纯度的rdESAT6蛋白。rdESAT6在分泌表达过程中被糖基化导致分子量偏高,采用糖苷内切酶H(Endo H)消化后,分子量为24kD,经Western Blot鉴定可与相应抗体产生特异性免疫反应,在酶联免疫斑点实验中也表现出特异的免疫斑点反应。结论:毕赤酵母可以分泌表达结核分枝杆菌rdESAT6蛋白抗原,产量可达5mg/L。表达过程中蛋白被糖基化修饰,但对其抗原特异性无本质影响,并能够有效的刺激记忆T细胞产生细胞因子IFN-γ。本实验作为对结核病早期诊断采用的特异性抗原的一种探索性的尝试,为今后的研究提供了一种新思路。

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT6与rdESAT6在毕赤酵母中的克隆表达及其在结核早期诊断中的应用

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