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AP-2α在动脉粥样硬化和HeLa细胞凋亡中的作用

作　者: 甘露
导　师: 张健
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 动脉粥样硬化 泡沫细胞 CD36 激活蛋白-2 平滑肌细胞 激活蛋白-2α α1-肾上腺素拮抗剂 凋亡 宫颈癌 多沙唑嗪 HeLa细胞 转录因子
分类号: R543
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


第一部分转录因子AP-2α通过直接调节CD36参与动脉粥样硬化目的:转录因子激活蛋白-2α（AP-2α）在发育、分化和肿瘤过程中调节细胞型别的特异性基因的表达,但迄今为止,还未见AP-2α在动脉粥样硬化中发挥作用的相关报道。目前的研究在于探讨AP-2α通过直接调节CD36基因在动脉粥样硬化的泡沫细胞形成中发挥的潜在作用。方法:本研究应用免疫组化和双免疫荧光染色检测AP-2α在apoE-/-小鼠和人动脉粥样硬化病变的表达;相对定量PCR、westernblot和免疫荧光染色检测AP-2α对大鼠血管平滑肌细胞表达CD36的影响;油红O染色和高效液相色谱分析法测量大鼠血管平滑肌细胞内的脂质蓄积;萤光素酶分析试验、电泳迁移率变动分析试验和染色质免疫沉淀法用于证明AP-2α对CD36基因启动子的直接调节。结果:AP-2α主要在apoE-/-小鼠和人动脉粥样硬化病变的泡沫细胞内高表达。AP-2α上调大鼠血管平滑肌细胞CD36基因的mRNA和蛋白表达并促进大鼠血管平滑肌细胞内的脂质蓄积。AP-2α过表达能增强CD36基因启动子活性,在CD36基因启动子区域存在两个AP-2结合位点,突变这两个结合位点能削弱AP-2α对CD36基因启动子活性的增强效应。结论:AP-2α通过直接调控CD36基因的表达来增加细胞对脂质的摄取,从而在动脉粥样硬化的形成中发挥了作用。第二部分转录因子AP-2α参与多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡目的:研究α1-肾上腺素受体拮抗剂多沙唑嗪对HeLa细胞凋亡的影响以及转录因子AP-2α在多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡中发挥的作用。方法:不同浓度的多沙唑嗪处理HeLa细胞16h,通过DNA片断形成分析、Hoechst 33258染色和流式分析检测多沙唑嗪对HeLa细胞凋亡的影响;以相对定量PCR和Western blot分析检测AP-2α和caspase-3的表达。以AP-2α过表达质粒或反义AP-2α寡核苷酸分别转染HeLa细胞后,通过流式检测凋亡效应;相对定量PCR和Western blot分析检测AP-2α和caspase-3的表达;比色法检测caspase-3的酶活性。结果:多沙唑嗪以剂量依赖性方式增加HeLa细胞的凋亡率和总细胞死亡率,并以剂量依赖性方式上调AP-2α和caspase-3的表达,caspase-3的活性也呈剂量依赖性方式增长。AP-2α的过表达导致多沙唑嗪诱导的HeLa细胞的凋亡率和总细胞死亡率增加,而反义AP-2α却导致多沙唑嗪诱导的HeLa细胞的凋亡率和总细胞死亡率降低。此外,过表达的AP-2α增强caspase-3的表达和活性,而反义AP-2α部分地阻断了多沙唑嗪对caspase-3表达及活性的增强效应。结论:多沙唑嗪以剂量依赖性方式诱导HeLa细胞凋亡,转录因子AP-2α在多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡中发挥了作用。

全文目录


英文缩写表  3-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-15
综述  15-57
  1.转录因子AP-2概述  15-20
    1.1 AP-2家族的结构  15-16
    1.2 AP-2与胚胎发育  16-17
    1.3 AP-2调控细胞生长  17-18
    1.4 AP-2与肿瘤  18-20
  2.动脉粥样硬化概述  20-26
    2.1 AS的流行病学及危险因素  21-22
    2.2 AS的病理变化  22-26
  3.AP-2与AS相关基因的联系  26-42
    3.1 AP-2与apoE  27-30
    3.2 AP-2与MMP  30-33
    3.3 AP-2与脂联素  33-35
    3.4 AP-2与VEGF  35-38
    3.5 AP-2与ABCA1  38-42
  4.小结  42-43
  5.参考文献  43-57
第一部分 转录因子AP-2α通过直接调节CD36参与动脉粥样硬化  57-121
  前言  57-62
  材料与方法  62-84
    1.仪器设备  62-63
    2.材料与试剂  63-69
    3.实验方法  69-83
      3.1 载体构建和寡核苷酸合成  69-70
      3.2 细胞培养与瞬时转染  70-73
      3.3 oxLDL的制备和鉴定  73
      3.4 免疫组化染色  73-74
      3.5 原位杂交检测  74-75
      3.6 RNA抽提和相对定量RT-PCR  75-76
      3.7 免疫沉淀和Western Blot检测  76-78
      3.8 细胞免疫荧光  78
      3.9 油红0染色检测细胞内中性脂质  78-79
      3.10 高效液相色谱(HPLC)检测细胞内胆固醇及胆固醇酯含量  79
      3.11 萤光素酶试验(Luciferase assay)  79-80
      3.12 电泳迁移率变动分析试验(EMSA)  80-81
      3.13 染色质免疫沉淀(ChIP)  81-83
    4.统计学分析  83-84
  实验结果  84-105
    1.AP-2α在AS病变血管内表达  84-88
    2.AP-2α对大鼠血管平滑肌细胞表达CD36的影响  88-91
    3.AP-2α对oxLDL诱导大鼠血管平滑肌细胞积蓄脂质的影响  91-95
    4.AP-2α结合到CD36的启动子区域  95-99
    5.CD36基因启动子区域AP-2结合位点的鉴定  99-101
    6.AP-2α对ABCA1的mRNA水平的影响  101-102
    7.多沙唑嗪对AP-2α调控CD36和ABCA1的影响  102-105
  讨论  105-121
    1.转录因子在AS中的作用  105-109
      1.1 NF-κB在AS中的作用  105-107
      1.2 PPAR在AS中的作用  107-109
    2.转录因子AP-2α在AS中的可能作用  109-116
    3.以转录因子为靶标防治AS疾病  116-121
      3.1 NF-κB作为药物治疗靶点的研究  116-118
      3.2 PPAR作为药物治疗靶点的研究  118-119
      3.3 AP-2α可望作为药物治疗靶点的研究  119-121
第二部分 转录因子AP-2α参与多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡  121-143
  前言  121-123
  材料与方法  123-129
    1.仪器设备与试剂配制  123
    2.实验方法  123-129
      2.1 质粒构建、寡核苷酸合成以及药品  123
      2.2 细胞培养和瞬时转染  123-124
      2.3 RNA抽提和相对定量RT-PCR  124
      2.4 Western blot分析  124
      2.5 DNA ladder检测  124-125
      2.6 Hoechst 33258染色  125
      2.7 流式分析  125-126
      2.8 Caspase-3活性分析  126-128
      2.9 统计学分析  128-129
  实验结果  129-138
    1.多沙唑嗪以剂量依赖性方式诱导HeLa细胞凋亡  129-132
    2.AP-2α参与多沙唑嗪诱导的HeLa细胞凋亡  132-133
    3.多沙唑嗪上调AP-2α在HeLa细胞内的表达  133-134
    4.多沙唑嗪在HeLa细胞内通过AP-2α影响caspase-3路径  134-138
  讨论  138-141
  结语  141-143
参考文献  143-159
致谢  159-160
攻读博士学位期间已发表及待发表的学术论文  160-161

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病
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