学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

激活蛋白AP-2αsiRNA电转染牛双核滋养层巨细胞对其特异表达基因转录水平的影响

作　者: 周璇
导　师: 王根林
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 反刍动物双核滋养层巨细胞 激活蛋白2α Csh1 PRP-Ⅰ PAG1
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 3次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


2α(activator protein-2α,AP-2a,TFAP2A)为探讨转录激活蛋白对牛双核滋养层(binucleate trophoblast gant cells,BNC)巨细胞特异表达基因的转录调控作用,本实验培养了牛原代滋养层巨细胞,对其进行了核染色和细胞免疫化学染色鉴定,以建立AP-2αsiRNA细胞模型进行体外实验。采用电转技术将化学合成导入原代细胞,用流式细胞仪和荧光显微镜检测干扰效率,采用台盼蓝染色检测细胞存活率,优化转染条AP-2αsiRNA件以找到最佳电转参数；采用荧光定量PCR检测TFAP2A对内源的干扰效Cshl、PRP-Ⅰ率,筛选出最佳干扰位点；最后采用荧光定量PCR分别检测干扰后BNC特异表达基因PAG1和mRNA水平.的本研究主要分为两个部分：一、牛滋养层巨细胞的培养和鉴定取怀孕牛45-60天的完整子宫,无菌条件下收集胚胎子叶,Ⅰ型胶原酶消化分离细胞后采用Percoll细胞分离液纯化滋养层细胞。用含15%胎牛血清和滋养层细胞生长添加剂(trophoblast growth supplement,TGS)的DMEM培养基培养细胞,并用差异贴壁法再次进行纯化。采用台盼蓝和Hoechst33342细胞染色液对细胞活力及形态学进行分析。采用波形蛋白和角蛋白免疫细胞化学法进行鉴定。结果显示,本实验分离的细胞经台盼蓝染色后细胞存活率大于90%,用Percoll细胞分离法纯化后BNC的纯度可达30%,细胞培养10天后,BNC占细胞总数的45-50%。抗细胞角蛋白抗体检测呈阳性,抗波形蛋白抗体检测呈阴性,经核染可见典型双核特征。本实验建立了一种相对快速、简便、能够培养相对较高纯度的牛原代胚胎滋养层巨细胞的方法。二、AP-2αsiRNA电转染原代BNC细胞培养后第10天收获细胞,将化学合成的AP-2αaiRNA干扰链,采用电转仪转染入纯化后的BNC,首先转入带荧光标记基团的siRNA(NC-siRNA-FAM),4小时后用流式细胞仪和台盼蓝染色分别检测转染效率和细胞活率。再转入不同位点的干扰链,48小时后用实时荧光定量PCR检测AP-2αmRNA水平,以筛选出最佳干涉位点。以最佳干涉位点的siRNA进行实验,即转入该siRNA干扰链,48小时后RT-PCR测定Cshl、PRP-Ⅰ和PAG1的mRNA水平。本研究采用电转染方法,结果显示,最佳优化条件为：细胞密度调整为500μ1 PBS含2×106个细胞,加入6μg NC-siRNA-FAM,电转参数为2×120V,2ms。在此参数下阳性细胞率达到93.5±1.66%,且细胞存活率为78.56+5.93%。初步建立了有效的siRNA电转入牛滋养层巨细胞的方法。PCR结果显示,与对照组和ns-siRNA组相比,AP-2αsiRNA干扰效率可达72.30±3.28%,差异极显著(P<0.01),转染后内源性Cshl和PRP-Ⅰ的mRNA水平分别下降了65.45±6.38%,40.73+11.72%,差异极显著(P<0.01)；而PAG1的mRNA水平减少了11.59+1.88%,与ns-siRNA组相比差异不显著(P>0.05),数据表明AP-2a可能直接作用于Csh1和PRP-Ⅰ基因的AP-2结合位点,或与AP-2其他家族成员或转录因子共同作用从而参与了Cshl和PRP-Ⅰ基因的转录调控,而AP-2α对PAG1的转录调控还有待研究。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略语中英文对照(Abbreviation)  11-12文献综述  12-26  1 牛的子叶型胎盘(Cotyledonary placenta)  12  2 反刍动物双核滋养层巨细胞的来源和结构  12-13  3 反刍动物双核滋养层巨细胞的妊娠特异蛋白家族  13-16    3.1 胎盘催乳素家族(placental lactogen,PL)  14-15    3.2 催乳素相关蛋白家族(Placental prolactin-related protein,PRP)  15-16    3.3 妊娠相关糖蛋白家族(pregnancy-associated glycoprotein,PAG)  16  4 Csh1、PRP-Ⅰ和PAG1在牛胎盘上的时空特异表达  16-18    4.1 Csh1  17    4.2 PRP-Ⅰ  17    4.3 PAG1  17-18  5 激活蛋白AP-2可能参与滋养层细胞特异表达基因的转录调控  18-19  6 siRNA电转染干扰法分析转录调控  19-20  参考文献  20-26试验研究  26-49  试验一 牛双核滋养层巨细胞体外培养模型的建立  26-36    1 材料和方法  27-29      1.1 材料  27      1.2 原代细胞培养  27-28      1.3 原代细胞纯化  28      1.4 细胞活力检测  28      1.5 Hoechst33342核染色鉴定双核  28-29      1.6 细胞免疫荧光化学法鉴定细胞  29    2 结果  29-31      2.1 细胞分离结果及形态观察  29-30      2.2 Hoechst33342细胞核染色和细胞免疫荧光化学染色结果  30-31    3 讨论  31-33    参考文献  33-36  试验二 AP-2asiRNA电转染BNC对BNC特异表达基因转录水平的影响  36-49    1 材料和方法  37-39      1.1 材料  37      1.2 siRNA设计与合成  37      1.3 细胞电转染条件优化  37-38      1.4 Real-time PCR检测AP-2asiRNA干扰效率  38-39      1.5 Real-time PCR检测Csh1,PRP-Ⅰ和PAG1的mRNA水平  39      1.6 数据分析  39    2 结果  39-44      2.1 不同电转参数下的细胞转染效率及存活率  39-41      2.2 AP-2a siRNA干扰效率  41-42      2.3 转染后Csh1,PRP-Ⅰ和PAG1mRNA水平  42-44    3 讨论  44-47    参考文献  47-49全文结论  49-50附录  50-52攻读硕士学位期间发表论文  52-54致谢  54

相似论文

  1. AP-2α在动脉粥样硬化和HeLa细胞凋亡中的作用,R543
  2. 核转录因子激活蛋白2α对肺腺癌A549细胞血管内皮生长因子基因/蛋白质表达的影响及意义,R734.2
  3. 1. 脑外伤后蓝斑和肾上腺髓质酪氨酸羟化酶的表达及其调控机制 2. 激活的Notch通路对嗅鞘细胞增殖和成鞘能力的影响,R651.15
  4. AMP激活蛋白激酶α亚基C末端影响激酶活性,R341
  5. 肉牛养殖过程中重金属类危害性因素分析,S823
  6. 热应激肉牛营养与环境调控技术及其行为研究,S823
  7. 蛋氨酸羟基类似物异丙酯对奶牛瘤胃发酵和生产性能的影响,S823.8
  8. 夏南牛和皮南牛微卫星标记研究及生长发育模型的建立,S823
  9. 公牛HSP基因多态性与精液品质及后裔性能的相关分析,S823
  10. 牛SYCP3基因的克隆、表达与启动子区甲基化分析,S823
  11. 夏南牛和中国西门塔尔牛肉品特性的比较研究,S823
  12. 产甘油益生菌的分离鉴定及其发酵条件的优化,S823.5
  13. 半胱胺制剂对新生犊牛早期断奶成功率和免疫功能的影响,S823.5
  14. 转IRF-1基因牛胎儿成纤维细胞的BVDV及IBRV抗性研究,S823
  15. 植物甾醇在奶牛上的应用及其机理初探,S823
  16. 冷季母牛舍空气中CH4、CO2和NH3等气体浓度的变化及影响因素的研究,S823
  17. 代乳品的饲喂量和饲喂方式对犊牛生长代谢、采食及相关行为的影响,S823.91
  18. 新疆褐牛POU1F1、GH、IGF1、IGF2基因多态性与早期生长发育性状的相关性研究,S823.9
  19. 运用PCR-DGGE和Real-time PCR方法分析奶牛瘤胃微生物区系差异,S823
  20. 新疆呼图壁种牛场荷斯坦牛遗传参数估计和动物模型BLUP遗传评定研究,S823.9

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
© 2012 www.xueweilunwen.com