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伴放线放线杆菌在龈下菌斑中的分布及其细胞膨胀致死毒素的研究

作　者: 孟姝
导　师: 刘天佳；吴亚菲
学　校: 四川大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素 TA克隆原核表达质粒构建
分类号: R781.4
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

牙周炎是一种慢性细菌感染性疾病，能引起牙周结缔组织的破坏和牙槽骨吸收，导致牙齿松动、脱落。伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，A．actinomycetemcomitans)是目前公认的牙周炎主要致病菌之一。A．actinomycetemcomitans又被称为伴放线菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans)，主要存在于龈下菌斑中，能合成分泌多种细胞毒力因子。大量研究发现，A．actinomycetemcomitans和局限型侵袭性牙周炎(localized aggressive periodontitis，LAP)密切相关。在慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)患者和牙周健康者的龈下菌斑中也经常检测到A．actinomycetemcomitans的存在，但国内外学者对其在慢性牙周炎患者和牙周健康者龈下菌斑中分布的研究结果差异较大。为了探索A．actinomycetemcomitans在慢性牙周炎患者和牙周健康者龈下菌斑中的分布规律，本研究采用了目前国际通用的16S rRNA聚合酶链反应(16S ribosomal RNA polymerase chain reaction，16S rRNA PCR)技术，检测慢性牙周炎患者和健康人龈下菌斑中A．actinomycetemcomitans的携带率，并分析了A．actinomycetemcomitans分布与牙周临床指标的关系。本研究第一部分应用16S rRNA PCR技术检测慢性牙周炎患者和牙周健康者龈下菌斑中的A．actinomycetemcomitans，结果发现中重度牙周炎患牙位点的A．actinomycetemcomitans检出率为33．62％，显著高于慢性牙周炎患者相对健康牙和牙周健康者健康牙的位点检出率(P＜0．05)；男性和女性慢性牙周炎患者的A．actinomycetemcomitans位点检出率没有统计学差异，但年轻患者的位点检出率明显高于中、老年患者(P＜0．05)。A．actinomycetemcomitans在牙周组织破坏严重的患牙位点检出率要高于破坏较轻的位点。A．actinomycetemcomitans在PD≥7mm的牙周炎患牙位点的检出率显著高于PD 4～6mm的位点，而PD 4～6mm的患牙位点A．actinomycetemcomitans检出率又显著高于PD≤4mm的位点(P＜0．05)。CAL对A．actinomycetemcomitans检出率的影响也呈相同趋势，CAL≥6mm的患牙位点检出率最高，3～5mm次之，CAL≤3mm的患牙位点A．actinomycetemcomitans检出率最低(P＜0．05)。此外，在BOP阳性位点的检出率高于阴性位点，说明A．actinomycetemcomitans在炎症活跃期位点的分布较多。A．actinomycetemcomitans能合成分泌多种细胞毒力因子，其中细胞膨胀致死毒素(cytolethal distending toxin，CDT)是一种由三个蛋白亚基组成的异聚体，具有引起细胞形态改变、细胞周期阻滞、诱导淋巴细胞凋亡和刺激炎性细胞因子分泌的功能。目前，细胞膨胀致死毒素与A．actinomycetemcomitans致病性的关系已引起国外学者的广泛关注，而国内尚未见相关报道。本研究第二部分采用PCR技术扩增出A．actinomycetemcomitans基因组中的CDT编码基因cdtABC，将获取的基因片断通过TA克隆、限制性酶切和连接，构建出pQE60-cdtABC重组质粒。测序报告证实重组质粒中嵌入的cdtABC基因和原始序列的同源性高达99％。用重组质粒转染E．coli感受态细胞，并用诱导剂诱导重组CDT蛋白的表达，通过SDS-PAGE和Western blot检测，发现E．coli感受态细胞的总蛋白中有重组CDT蛋白的表达。综上所述，慢性牙周炎患者中患牙位点的A．actinomycetemcomitans检出率显著高于慢性牙周炎患者的相对健康位点和牙周健康者的位点检出率。A．actinomycetemcomitans在年轻的慢性牙周炎患者中检出率高于中、老年患者，而且它的检出率还随着牙周组织破坏程度的加重而升高。本研究进一步利用PCR技术克隆出编码A．actinomycetemcomitans CDT的cdtABC基因，通过TA克隆成功构建了pQE60-cdtABC载体，并在大肠杆菌感受态细胞中成功表达出重组CDT蛋白，为进一步研究CDT蛋白的生物学活性和细胞信号转导机制以及A．actinomycetemcomitans的致病机理奠定了研究基础。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-17
第一部分伴放线放线杆菌在不同牙周状况人群龈下菌斑中的分布研究  17-29
  实验一伴放线放线杆菌在不同牙周状况人群龈下菌斑中的分布  18-29
    1 材料和方法  18-22
    2 结果  22-25
    3 讨论  25-28
    结论  28-29
第二部分伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素的研究  29-69
  实验二伴放线放线杆菌的细胞膨胀致死毒素的重组质粒的构建  31-59
    1 材料和方法  31-40
    2 结果  40-52
    3 讨论  52-58
    结论  58-59
  实验三伴放线放线杆菌的细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达  59-69
    1 材料和方法  59-63
    2 结果  63-66
    3 讨论  66-68
    结论  68-69
全文总结  69-71
参考文献  71-82
综述  82-95
个人简历  95-96
致谢  96

伴放线放线杆菌在龈下菌斑中的分布及其细胞膨胀致死毒素的研究

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