学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备

作　者: 田兆菊
导　师: 赵宏坤；张志芳；牟志美
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛白细胞介素-18 原核表达昆虫杆状病毒表达载体生物学活性测定单克隆抗体制备家蚕生物反应器
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 437次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是Okamura等(1995)从小鼠肝脏中克隆获得的。Nakamori等(2003)研究发现,IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节等方面有着重要的作用,具有免疫治疗及免疫佐剂的作用,有潜在的应用前景。同时,随着奶牛业的发展,奶牛病特别是奶牛乳腺炎呈上升趋势,迫切需要新型疫苗与疫苗佐剂的研发。鉴于此,本实验室对牛白介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)进行了克隆表达,旨在探索利用BoIL-18能促进机体免疫功能的特性,将其应用于奶牛病的预防及临床治疗。本试验针对如何获得高效表达且具有生物学活性的BoIL-18蛋白及利用表达的蛋白如何制备BoIL-18单克隆抗体这些问题进行了探讨,主要包括以下四部分:第一部分:牛IL-18成熟蛋白基因的原核表达及生物学活性测定。根据已发表序列,设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pMDT-BoIL-18中进行PCR扩增,然后亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中,转化至大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中获得重组菌株,将该重组菌在IPTG的诱导下进行表达,用SDS-PAGE、Western blot分析表达情况;用谷胱甘肽琼脂糖(GST)亲和层析树脂对表达产物进行纯化,分析纯化产物的生物学活性。结果表明,BoIL-18重组菌经0.3mmol/L IPTG诱导8h,SDS-PAGE电泳分析获得了一条表达条带,分子量约为44KD,凝胶薄层扫描分析显示,表达的蛋白占工程菌菌体总蛋白的31.8%;生物学活性测定表明,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.10mg/L时,对外周血单个核细胞(PBMC)有明显的增殖作用;BoIL-18融合蛋白浓度大于0.20 mg/L时,能诱导牛脾淋巴细胞产生IFN-γ,且随着BoIL-18浓度的增加,对IFN-γ的诱生作用增强;BoIL-18融合蛋白诱导脾淋巴细胞产生的IFN-γ有抑制水泡性口炎病毒(VSV)产生细胞病变的作用,且随IFN-γ产生量的增加,对VSV病毒的抑制作用增加。第二部分:牛IL-18成熟蛋白基因在昆虫杆状病毒表达载体中的表达及生物学活性测定。根据已发表序列,设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pMDT-BoIL-18中进行PCR扩增,然后亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTb中,构建重组转移载体质粒pFastBac HTb-BoIL18,将其转化至DH10Bac感受态细胞中得到重组Bacmid(Bacmid-BoIL18)。在转染试剂Cellfectin的作用下,将Bacmid-BoIL18转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9,sf9)获得重组杆状病毒,然后将重组杆状病毒感染sf9,感染后在不同时间收获sf9细胞及培养上清,应用SDS-PAGE电泳、Western blot分析表达情况;用Ni-NTA树脂对表达产物进行纯化,分析纯化产物的生物学活性。结果表明,BoIL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞sf9中获得了表达,表达的目的条带分子量为26KD,经薄层凝胶扫描分析证实,表达量占总蛋白的21.3%;生物学活性分析表明,BoIL-18蛋白浓度大于0.05 mg/L时,具有明显加强PBMC的增殖的作用;当其浓度大于0.10 mg/L时,能诱导牛脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着BoIL-18蛋白浓度的增加,诱导产生IFN-γ的量随之增加;通过诱导牛脾细胞产生IFN-γ,间接地抑制VSV产生细胞病变,且随IFN-γ产生量的增加,对VSV病毒的抑制作用增加。第三部分:BoIL-18单克隆抗体的制备。本试验将第一部分中获得的BoIL-18的原核表达产物作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾与骨髓瘤细胞sp2/0在PEG的作用下进行融合;将第二部分中获得的BoIL-18在昆虫细胞sf9中的表达产物作为筛选抗原,利用间接ELISA方法反复筛选,应用有限稀释法进行多次克隆化后,最终获得了两株可分泌BoIL-18单克隆抗体的阳性细胞克隆。Western-blot证实,获得的单克隆抗体具有良好的特异性;间接ELISA试验检测单克隆抗体5G8和7B3的效价分别为1×105和1×106。对已经冻存的杂交瘤细胞株分别在第3月复苏,用间接ELISA检测杂交瘤细胞株的抗体效价不变,表明所获得的杂交瘤细胞株具有良好的稳定性。两株细胞克隆亚类均为IgG l。第四部分:牛IL-18成熟蛋白基因在家蚕幼虫中的表达。设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pET-BoIL-18中进行PCR扩增,然后将其亚克隆至转移载体pVL1393中,在转染试剂Lipofectin的作用下,与线性化的病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞Bm5,用蓝白斑法筛选出重组病毒BmBacPAK-BoIL-18,经PCR鉴定正确后将重组病毒接种至5龄家蚕幼虫体内,饲养一段时间,取家蚕血淋巴进行SDS-PAGE电泳分析与Western blot印迹测定,分析表达情况。结果表明,BoIL-18在家蚕幼虫体内成功地获得了表达,经凝胶薄层扫描分析显示,表达的目的条带占蚕血淋巴总蛋白的16.7%,Western blot分析证明,在相对分子质量(Mr)为18 000处有一特异性表达条带。

全文目录

中文摘要  10-12
英文摘要  12-15
前言  15-32
  第一部分白细胞介素-18 的研究进展  15-26
    1.1 IL-18 的发现  15
    1.2 IL-18 的分布及产生  15-16
    1.3 IL-18 的分子特性  16-17
    1.4 IL-18 的基因结构和基因表达调控  17
    1.5 IL-18 的信号转导  17-19
    1.6 IL-18 的生物学作用  19-21
    1.7 IL-18 与疾病  21-23
    1.8 牛IL-18的研究进展  23-24
    1.9 IL-18 的研究及应用前景  24-26
  第二部分家蚕/杆状病毒表达系统研究进展  26-32
    2.1 家蚕/BmNPV 表达载体系统的优势  26-27
    2.2 家蚕/Bm NPV 表达系统的原理  27-28
    2.3 国内外研究现状  28-29
    2.4 影响家蚕/BmNPV 表达载体系统表达量的因素  29-32
实验研究  32-108
  第一部分牛 IL-18 融合蛋白的原核表达及生物学活性测定  32-58
    1 材料与方法  33-49
    2 结果与分析  49-55
    3 讨论  55-58
  第二部分牛IL-18成熟蛋白基因在昆虫杆状病毒表达载体中的表达及其生物学活性测定  58-83
    1 材料和方法  59-75
    2 结果与分析  75-81
    3 讨论  81-83
  第三部分 BoIL-18 单克隆抗体的制备  83-95
    1 材料和方法  83-90
    2 结果与分析  90-92
    3 讨论  92-95
  第四部分 BoIL-18成熟蛋白基因在家蚕幼虫中的表达  95-108
    1.材料和方法  95-103
    2 结果与分析  103-106
    3 讨论  106-108
结论  108-109
创新之处  109-110
参考文献  110-125
致谢  125-126
攻读博士学位期间发表论文情况  126

牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备

内容摘要

全文目录

相似论文