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黄瓜（Cucumis sativus L.）酸性α-半乳糖苷酶的离体表达与酶学性质研究

作　者: 张宗东
导　师: 缪旻珉
学　校: 扬州大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 黄瓜 酸性α-半乳糖苷酶 昆虫杆状病毒表达载体 Km
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 75次
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内容摘要


黄瓜(Cucumis sativus L.)以水苏糖作为体内同化物的主要运输形式,而α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是催化黄瓜体内水苏糖分解的关键酶。为研究黄瓜体内水苏糖卸出的分子机制,本实验室前期克隆了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的cDNA全长序列。为验证这2个基因克隆的正确性,研究它们的酶学性质,指导后续的分离纯化实验,探索它们在黄瓜水苏糖代谢中的生理功能,本实验采用昆虫杆状病毒表达载体系统离体表达了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因。为此,本实验设计了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的特异引物,运用聚合酶链式反应(PCR)技术,扩增其编码区序列,经连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选重组子,构建杆状病毒表达载体。利用野生型杆状病毒和表达载体共转染健康的昆虫细胞系Sf9,生产重组病毒,离体表达了2个待验证基因。经检测表明2个基因在昆虫细胞中的表达产物均具有酸性α-半乳糖苷酶活性,证明这2个基因确实为酸性α-半乳糖苷酶基因。进一步研究了离体表达的2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶对人工底物pNPG的最佳反应pH值、最适反应温度、米氏常数(Km)、最大反应速度(Vm)、D-半乳糖对活性的抑制效应以及对水苏糖、棉籽糖的催化活性。结果表明:黄瓜α-半乳糖苷酶Ⅰ对pNPG的最佳反应pH值为4.8,最适反应温度为30℃,对pNPG的Km为8.99×10-4mol/L,Vm为3.34×10-2mol/L·min;黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅱ对pNPG的最佳反应pH值为6.1,最适反应温度为35-40℃,对pNPG的Km为1.35×10-3mol/L,Vm为3.36 mol/L·min。低浓度的D-半乳糖对2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶活性均具有显著的抑制作用。2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶对棉籽糖均具有较高的亲和性,对水苏糖的亲和性相对较低。

全文目录


中文摘要  9-10
英文摘要  10-12
引言  12-13
1 文献综述  13-23
  第一部分 高等植物中α-半乳糖苷酶的不同形式及其酶学性质  13-17
    1.1 高等植物中α-半乳糖苷酶与水苏糖卸出的关系  13-14
    1.2 α-半乳糖苷酶在高等植物中的不同形式和分布  14-15
    1.3 α-半乳糖苷酶在高等植物中的酶学性质  15-16
    1.4 研究展望  16-17
  第二部分 昆虫杆状病毒表达载体系统及其应用研究进展  17-23
2 黄瓜酸性α-半乳糖苷酶昆虫杆状病毒表达载体的构建  23-35
  2.1 材料、试剂与方法  23-28
    2.1.1 材料  23
    2.1.2 试剂、载体  23
    2.1.3 方法  23-28
  2.2 结果与分析  28-35
    2.2.1 黄瓜幼叶总RNA 的提取  28-29
    2.2.2 RT-PCR反应扩增2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶编码区  29
    2.2.3 巢式PCR 验证回收的目的片段  29-30
    2.2.4 重组质粒的酶切验证分析  30-31
    2.2.5 重组质粒的PCR 验证分析  31-32
    2.2.6 序列测定结果与分析  32-35
3 黄瓜酸性α-半乳糖苷酶的离体表达  35-42
  3.1 试剂和技术路线  35-36
    3.1.1 试剂  35
    3.1.2 技术路线  35-36
  3.2 实验方法  36-38
    3.2.1 昆虫Sf9 细胞系培养  36
    3.2.2 表达载体的准备  36
    3.2.3 重组质粒的提取  36
    3.2.4 共转染  36-37
    3.2.5 扩增病毒产生高滴度病毒储液  37
    3.2.6 接种病毒，表达重组蛋白  37
    3.2.7 目的蛋白的收获  37-38
    3.2.8 目的蛋白的活性检测  38
  3.3 结果与分析  38-42
    3.3.1 昆虫sf9 细胞系培养  38-39
    3.3.2 表达载体的准备  39
    3.3.3 共转染  39-40
    3.3.4 目的蛋白的表达及活性检测  40-42
4 黄瓜酸性α-半乳糖苷酶的酶学性质研究  42-50
  4.1 试剂和方法  42-43
    4.1.1 试剂  42
    4.1.2 方法  42-43
  4.2 结果与分析  43-50
     4.2.1 最佳 pH 的确定  43-45
    4.2.2 最适反应温度的确定  45-46
    4.2.3 Km 值和Vm 值的测定  46-48
    4.2.4 D-半乳糖的抑制作用  48-49
    4.2.5 对棉籽糖和水苏糖的催化活性  49-50
5 结论与讨论  50-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
攻读学位期间发表或待发表的学术论文目录  59-60

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 瓜类 > 黄瓜
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