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水牛卵母细胞体外成熟与凋亡的初步研究

作　者: 王晓丽
导　师: 石德顺
学　校: 广西大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 水牛 卵母细胞 体外成熟 皮质颗粒 凋亡 颗粒细胞 发育潜能
分类号: S823
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


为进一步完善水牛卵母细胞体外成熟培养体系，对水牛卵母细胞体外成熟的影响因素，卵母细胞体外成熟和受精过程中的皮质颗粒变化规律，以及体外成熟过程中卵母细胞和颗粒细胞的凋亡情况进行了系统研究。分别以第一极体的排放和皮质颗粒(cortical granules，CGs)单层分布于质膜下作为水牛卵母细胞核、质成熟的指标对表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF-I)对水牛卵母细胞体外成熟的影响进行了研究。结果发现，(1)在成熟基础液中添加10、20、30 ng/mL EGF对水牛卵母细胞的成熟率无明显影响，但EGF浓度升高到50 ng/mL时，水牛卵母细胞第一极体排出率显著提高(55.4％vs 32.3％，P＜0.05)，当EGF浓度升高到100ng／mL时，卵母细胞的成熟率下降；CGs的分布随着EGF浓度的升高逐步由中间分布向皮层分布转变，EGF浓度为50 ng/mL时皮层分布的卵母细胞比例最高，当EGF浓度升高到100 ng/mL时，CGs又向中间分布转变。(2)在成熟液中添加10 ng/mL的IGF-I对水牛卵母细胞体外成熟无显著影响(P＞0.05)；但添加30 ng/rnL的IGF-I能显著提高水牛卵母细胞体外成熟率(P＜0.05)，CGs的分布随着IGF-I浓度的升高逐步由中间分布向皮层分布转变，IGF-I浓度为30 ng/mL时，皮层分布的卵母细胞比例最高，随着IGF-I浓度的进一步升高(50、100 ng/mE)，CGs又向中间分布转变。(3)成熟基础液中添加20 ng／mL EGF+30 ng/mL IGF-I的卵母细胞体外成熟率显著高于添加20 ng/mL EGF组和对照组(P＜0.05)。以上结果表明，适宜浓度的EGF和IGF-I对水牛卵母细胞体外成熟具有促进作用，且两者具有协同作用。研究了水牛多卵细胞在体外成熟及体外受精过程中的CGs变化规律。用FITC-LCA标记不同体外成熟时间、体外受精时间的水牛卵母细胞的CGs，然后用激光共聚焦显微镜检测其分布情况。结果发现，CGS在水牛卵母细胞体外成熟培养前，70.1％卵母细胞的CGs呈现中间分布，体外成熟16h后，CGs呈皮层分布的卵母细胞比例增多，达到22.1％。培养24 h后，CGs皮层分布的卵母细胞达到59.8％，分布形式由完全聚合向完全分散逐步转变。对不同体外成熟时间的卵母细胞进行体外受精时发现，体外成熟12 h的卵母细胞仅在受精后3 h有12.9％的CGs外排。成熟20 h的卵母细胞在受精后1.5 h有48.5％的CGs外排，成熟24 h的卵母细胞受精后1.5 h的CGs外排率可达到97.1％，3 h后达100％。同时也对化学激活后水牛卵母细胞的CGs分布情况进行了测定，发现化学激活也可以引起CGs的排放，体外成熟12 h的卵母细胞仅在激活后3 h有10.0％的CGs外排。成熟20 h的卵母细胞激活后0.5 h没有CGs外排，激活后1.5 h CGs外排仅达到33.3％，明显低于受精。体外成熟24 h的卵母细胞在激活后1.5 h CGs外排率可达到96.7％。以上结果表明，随着成熟时间的延长，CG的分布由中间分布逐渐向皮层分布转变，受精和激活后的CG排放速度与卵子本身的成熟度有着直接的关系，且化学激活引起的CGs排放速度比体外受精迟缓。研究了EGF和IGF-I对水牛卵母细胞成熟培养过程中凋亡的影响。结果发现，(1)在成熟基础液中添加不同浓度的EGF(10、20、30、50、100ng／mL)都可以降低卵母细胞的凋亡率；添加20 ng／mL EGF的卵母细胞凋亡率为10.9％，显著低于对照组(29.4％，P＜0.05)；随着EGF浓度的提高，卵母细胞的凋亡率随之下降，当EGF浓度添加至50 ng/mL时，卵母细胞凋亡率达到6.2％，显著低于对照组和10 ng／mL组(P＜0.05)，与其它实验组无显著差异(P＞0.05)。(2)在成熟基础液中添加10，30，50和100 ng/mL的IGF-I，卵母细胞凋亡率(8.2％，7.6％，10.6％和15.4％)均显著低于对照组(36.4％，P＜0.05)，其中100 ng／mL组的卵母细胞凋亡率显著高于10ng／mL组和30 ng／mL组(P＜0.05)，其余各组间差异不显著(P＞0.05)。(3)添加20 ng／mL EGF+30 ng/mL IGF-I组体外成熟卵母细胞的凋亡率低于添加30 ng／mL的IGF-I组和添加20 ng/mL EGF组以及对照组(P＜0.05)。(4)在添加有20 ng／mL EGF+30 ng／mL IGF-I的成熟液中成熟培养12 h、20 h和24 h的的卵母细胞成熟率分别为7.8％、50.9％和61.4％，卵母细胞凋亡率分别为1.7％、4.4％和4.7％，成熟差异显著(P＜0.05)，而凋亡率差异不显著(P＞0.05)。以上结果表明，适宜浓度的EGF和IGF-I可抑制水牛卵母细胞体外成熟过程中的凋亡发生，且两者具有协同作用。探讨了卵母细胞发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡之间的关系。结果发现，随着卵母细胞成熟时间的延长，凋亡率升高；此外，随着卵母细胞评分和发育潜能的降低，颗粒细胞凋亡率逐渐升高。由此表明卵母细胞发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡密切相关，通过测定颗粒细胞的凋亡率可预测未成熟卵母细胞的发育潜能。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-12
前言  12-14
第一章 卵母细胞体外成熟及其调控的研究概况  14-25
  1 影响卵母细胞体外成熟的因素  14-20
    1.1 动物种类、性机能状态和卵巢运输条件  14-15
    1.2 卵泡所处的发育阶段  15
    1.3 卵泡细胞  15-16
    1.4 卵泡液  16-17
    1.5 激素类  17-18
    1.6 生长因子与卵母细胞成熟调控  18-20
  2 卵母细胞核、质成熟的差异及成熟抑制  20-22
  3 皮质颗粒在卵母细胞成熟中的变化  22-25
第二章 哺乳动物细胞凋亡的研究进展  25-36
  1 细胞凋亡的一般概念  25-27
    1.1 细胞凋亡与坏死的区别  25-26
    1.2 细胞凋亡与细胞胀亡  26-27
  2 细胞凋亡的生物学特征  27-28
    2.1 形态学变化  27-28
    2.2 生物化学变化  28
  3 细胞凋亡的检测方法  28-30
    3.1 细胞凋亡的形态学检测方法  28-29
    3.2 细胞凋亡的生物化学检测  29-30
  4 关于卵母细胞凋亡  30-31
  5 卵母细胞凋亡的分子机理  31-32
  6 细胞因子与细胞凋亡  32-33
  7 颗粒细胞与卵母细胞的关系  33-36
    7.1 颗粒细胞对卵母细胞的作用  33-35
    7.2 卵母细胞对卵丘颗粒细胞功能的影响  35-36
第三章 表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF-I)对水牛卵母细胞体外成熟的影响  36-46
  1 材料和方法  37-39
    1.1 试剂及培养液的配制  37
    1.2 卵母细胞的收集、体外成熟  37-38
    1.3 卵母细胞核成熟的判定  38
    1.4 皮质颗粒染色及观察  38
    1.5 试验设计  38-39
    1.6 统计分析  39
  2 结果与分析  39-43
    2.1 水牛卵母细胞 CG分布的观察结果  39
    2.2 EGF对水牛卵母细胞体外成熟的影响  39-40
    2.3 IGF-I对水牛卵母细胞体外成熟的影响  40-41
    2.4 EGF、IGF-I对水牛卵母细胞体外成熟的影响  41-43
  3 讨论  43-45
    3.1 EGF对卵母细胞体外成熟的影响  43-44
    3.2 IGF-I对卵母细胞体外成熟的影响  44-45
    3.3 EGF和 IGF-I对卵母细胞体外成熟的影响  45
  4 结论  45-46
第四章 水牛卵母细胞体外成熟及体外受精过程中的皮质颗粒分布变化  46-54
  1 材料和方法  47-49
    1.1 试剂及培养液的配制  47
    1.2 卵母细胞的收集、体外成熟  47
    1.3 卵母细胞的体外受精  47-48
    1.4 卵母细胞的孤雌激活  48
    1.5 皮质颗粒染色及观察  48
    1.6 试验设计  48
    1.7 统计分析  48-49
  2 结果与分析  49-51
    2.1 体外成熟不同时间皮质颗粒的分布情况  49
    2.2 体外受精后不同时间皮质颗粒的分布与排放  49-50
    2.3 人工激活后不同时间皮质颗粒的分布与排放  50-51
  3 讨论  51-53
  4 结论  53-54
第五章 水牛卵母细胞体外成熟中凋亡的研究  54-72
  第一节 表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF-I)对水牛卵母细胞体外成熟培养过程中凋亡的影响  54-62
    1 材料与方法  55-57
      1.1 试剂及培养液的配制  55
      1.2 卵母细胞的收集、体外成熟  55-56
      1.3 卵母细胞凋亡的检测  56
      1.4 试验设计  56-57
      1.5 统计分析  57
    2 结果与分析  57-59
      2.1 EGF对水牛卵母细胞凋亡的影响  57
      2.2 IGF-I对水牛卵母细胞凋亡的影响  57-58
      2.3 EGF、IGF-I对水牛卵母细胞凋亡的影响  58-59
      2.4 不同成熟时间卵母细胞的凋亡情况  59
    3 讨论  59-60
    4 结论  60-62
  第二节 水牛卵丘颗粒细胞凋亡与卵母细胞发育潜能的初步研究  62-72
    1 材料与方法  62-65
      1.1 试剂及培养液的配制  62-63
      1.2 未成熟卵母细胞评分标准  63
      1.3 卵母细胞的收集、体外成熟  63
      1.4 卵母细胞的体外受精  63
      1.5 颗粒细胞单层的制备  63-64
      1.6 早期胚胎的体外培养  64
      1.7 卵丘颗粒细胞凋亡的检测  64
      1.8 试验设计  64-65
      1.9 统计分析  65
    2 结果与分析  65-67
      2.1 卵母细胞成熟情况与卵丘颗粒细胞凋亡  65-66
      2.2 卵母细胞发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡  66-67
    3 讨论  67-71
      3.1 关于未成熟卵母细胞的评分  67-69
      3.2 卵母细胞与颗粒细胞的关系  69-70
      3.3 颗粒细胞凋亡与卵母细胞的发育潜能  70-71
    4 结论  71-72
参考文献  72-101
英文缩写—中文对照表  101-103
论文图片及说明  103-110
致谢  110-111
自传  111
在读期间发表的论文  111

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
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