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咖啡因对小鼠卵母细胞老化调控作用的研究

作　者: 张振华
导　师: 谭景和
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医
关键词: 小鼠卵母细胞咖啡因老化纺锤体皮质颗粒
分类号: S865.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

卵母细胞成熟排卵后将停滞在MⅡ期等待精子穿入。如果受精未能及时发生卵母细胞会随着在输卵管中滞留时间的延长逐渐发生形态及生理生化变化,通常将这种现象称之为老化。老化会导致卵母细胞受精率下降,孤雌激活率和碎裂率的升高,皮质颗粒、纺锤体等细胞器分布和组装异常,多精受精比率上升,染色体形态的异常以及受精后胚胎发育能力下降。因此详细了解卵母细胞老化的分子机理以及老化过程中细胞器的变化,进而采取人为手段对卵母细胞老化进行调控将对体外受精(IVF)及体细胞核移植(SCNT)实验具有积极意义。本文系统研究了咖啡因(Caffeine)对小鼠卵母细胞体外(in vitro)老化的抑制作用。明确了咖啡因抑制老化所需浓度、作用时间及作用后所需的恢复时间等处理方案;研究了咖啡因处理对卵母细胞纺锤体形态、皮质颗粒排布以及孤雌激活后胚胎体外发育能力的影响;证实了卵丘在咖啡因抑制老化过程中的作用。实验结论简述如下:1.咖啡因对体内、外成熟卵母细胞的老化均具有抑制作用,但抑制所需浓度不同。6mM的咖啡因可以有效抑制体内成熟卵母细胞的老化,10mM可以完全抑制体内成熟卵母细胞的老化;大于0.5 mM的咖啡因即可以有效抑制体外成熟卵母细胞老化,8mM可以完全抑制体外成熟卵母细胞老化。2.咖啡因对体内、外成熟卵母细胞老化的抑制作用是可逆的。体内成熟卵母细胞用不同浓度咖啡因(6、8和10mM)处理后,在无咖啡因条件下恢复6小时,激活率可以恢复到对照组(未经咖啡因处理,仅老化6小时)的水平;同样体外成熟卵母细胞用不同浓度咖啡因(0.5和1 mM)处理后,恢复6小时,激活率与体外成熟的对照组相比差异也不显著(P>0.05)。3.咖啡因抑制卵母细胞老化对孤雌激活胚胎体外发育的影响。在应用咖啡因抑制体内成熟小鼠卵母细胞老化过程中,6mM咖啡因处理组囊胚发育率与对照组差异不显著(32.9% vs. 35.5%,P>0.05),但4-cell比率差异显著(P<0.05);8mM和10mM处理使囊胚发育率明显下降(20.9%,11.0%),且后者的囊胚率显著低于前者。我们随后选取8mM咖啡因将处理时间从6小时延长至12小时,囊胚发育率进一步下降(3.3%)。以上结果说明咖啡因在抑制老化过程中对卵母细胞造成了一定的伤害,且随着处理强度增加损伤程度也同时增加。4.咖啡因对已老化卵母细胞的逆转作用。应用8mM和10mM咖啡因处理hCG后18小时的体内成熟卵丘卵母细胞复合体(COCs,已经体内老化6h)并不能使其激活能力下降(85.8%, 91.1%);同时,如果在咖啡因处理前脱去卵丘(即利用咖啡因处理裸卵,DO)则能使其激活率下降(28.7%)。通过以上实验我们发现;咖啡因逆转已经老化卵母细胞的效果受到卵丘细胞的影响,在卵丘存在的情况下咖啡因的逆转作用并不明显。与此结果不同的是在体外成熟的卵母细胞中卵丘并不影响咖啡因的逆转作用。我们比较了体外培养20h后(老化6h)的COCs和DOs在0.5mM或2mM咖啡因作用6h的老化水平。实验结果表明两个浓度的咖啡因均能明显降低COCs和DOs的激活率(37.2%, 39.3%; 10.3%, 11.5%)。以上结果表明咖啡因对老化卵母细胞的逆转作用受卵母细胞成熟方式及卵丘细胞存在与否的影响。5. 8mM咖啡因抑制小鼠体内成熟卵母细胞老化过程对纺锤体形态及皮质颗粒分布的影响。在咖啡因处理6小时后,纺锤体形态没有受到明显影响;当处理时间延长到12h后具有正常形态的尖端纺锤体的卵母细胞比例明显下降(31.8% vs. 51.2%, P<0.05),在去除咖啡因并培养6h后纺锤体形态能够随之恢复(68.3%)。在咖啡因处理后具有正常分布皮质颗粒的卵母细胞的比例明显减少(9.6% vs. 85.5%, P<0.05),随着处理时间延长这一比例下降更为明显(0.0%),在去除咖啡因后也没有观察到皮质颗粒分布的恢复。这一结果说明咖啡因抑制卵母细胞老化过程影响纺锤体结构及皮质颗粒分布,但前者所受损伤能够恢复而后者所受伤害是不可逆的。

全文目录

中文摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
1. 引言  14-25
  1.1 卵母细胞老化的定义  14
  1.2 卵母细胞老化引起的危害  14-16
  1.3 卵母细胞老化过程中孤雌激活率的变化  16-17
  1.4 老化卵母细胞受精后发生异常Ca~(2+)波动  17
  1.5 卵母细胞老化与细胞凋亡  17-18
  1.6 卵母细胞老化对纺锤体和皮质颗粒的影响  18-20
    1.6.1 卵母细胞老化对纺锤体组装的影响  18-19
    1.6.2 卵母细胞老化对皮质颗粒迁移以及胞吐的影响  19-20
  1.7 老化卵母细胞MPF 活性的变化及分子调控机制  20-22
  1.8 咖啡因对卵母细胞老化的调控  22-24
    1.8.1 咖啡因的简介  22-23
    1.8.2 咖啡因对卵母细胞老化的调控  23-24
  1.9 论文主要研究内容  24-25
2. 材料与方法  25-31
  2.1 主要试剂及配制  25-27
  2.2 实验动物及超排处理  27
  2.3 卵母细胞的获取及体外成熟  27
  2.4 体内成熟卵母细胞的获取  27
  2.5 裸卵的制备  27-28
  2.6 卵母细胞体外老化处理  28
  2.7 乙醇结合6-DMAP 激活  28
  2.8 胚胎培养  28
  2.9 MPF 活性检测  28-29
    2.9.1 实验材料的制备  28-29
    2.9.2 蛋白磷酸化反应  29
    2.9.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳  29
    2.9.4 MPF 活性检测  29
  2.10 皮质颗粒染色  29-30
  2.11 卵母细胞纺锤体（α－微管蛋白）染色  30
  2.12 激光扫描共聚焦显微术  30
  2.13 数据处理  30-31
3. 实验设计  31-33
  3.1 抑制卵母细胞体外老化过程中所需要的咖啡因浓度  31
  3.2 咖啡因逆转老化卵母细胞（COC）的研究  31
  3.3 咖啡因逆转老化卵母细胞（DO）的研究  31
  3.4 抑制卵母细胞体外老化后能否恢复以及恢复所需要的时间  31-32
  3.5 体内成熟卵母细胞咖啡因处理后的发育  32
  3.6 体外成熟体外老化卵母细胞逆转后的发育  32
  3.7 咖啡因处理对纺锤体和皮质颗粒的的影响  32-33
4. 结果与分析  33-44
  4.1 咖啡因抑制体内卵母细胞老化所需要的浓度和逆转老化卵母细胞以及咖啡因处理后MPF 活性变化的研究  33-34
  4.2 咖啡因抑制体外卵母细胞老化所需要的浓度和逆转老化卵母细胞以及咖啡因处理后MPF 活性变化的研究  34-36
  4.3 不同浓度咖啡因处理后卵母细胞激活率恢复时间的研究  36-37
  4.4 不同浓度咖啡因处理后体外成熟卵母细胞激活率恢复时间的研究  37-38
  4.5 咖啡因抑制体内成熟卵母细胞恢复后的发育情况  38-40
  4.6 咖啡因逆转体外老化卵母细胞恢复后的发育情况  40-41
  4.7 咖啡因处理后对卵母细胞纺锤体形态的影响  41-42
  4.8 咖啡因处理后对卵母细胞皮质颗粒分布的影响  42-44
5. 讨论  44-50
  5.1 咖啡因对体内成熟卵母细胞老化的抑制作用和对体内已经老化卵母细胞的逆转作用  44-46
  5.2 咖啡因对体外成熟卵母细胞老化的抑制作用和对体外老化卵母细胞的逆转作用  46-47
  5.3 咖啡因抑制卵母细胞老化后,卵母细胞能否恢复以及恢复需要的时间（体内卵和体外卵）  47-48
  5.4 咖啡因抑制卵母细胞老化过程中，纺锤体形态的变化  48
  5.5 咖啡因抑制卵母细胞老化过程中，皮质颗粒分布的变化  48
  5.6 咖啡因处理对卵母细胞发育能力的影响  48-50
6. 结论  50-51
参考文献  51-61
图版说明  61-62
致谢  62-63
作者简介  63

咖啡因对小鼠卵母细胞老化调控作用的研究

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