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丙型肝炎病毒NS4A与钙离子信号调节亲环素配体相互作用的研究

作　者: 程勇前
导　师: 成军
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 丙型肝炎病毒非结构蛋白4A 钙离子信号调节亲环素配体 酵母双杂交 免疫共沉淀 细胞凋亡
分类号: R373
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 135次
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内容摘要


目的：探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)与钙离子信号调节亲环素配体(CAML)的相互作用、作用位点及相互作用后对细胞基因表达的影响。方法：应用酵母双杂交技术筛选人白细胞文库中与HCV NS4A相互作用的蛋白。对克隆重复率较高的CAML基因进行克隆，并构建其酵母表达载体，在酵母细胞中与HCV NS4A进行回交验证之后，构建HCV NS4A(pCMV／Myc-NS4A)及CAML(pcDNA3.1／His-A-CAML)的真核表达载体，共转染293细胞，进行免疫共沉淀验证实验。构建CAML不同剪接体及缺失突变体的酵母表达载体，转染入酵母Y187，分别在酵母细胞中与转染了HCV NS4A酵母表达载体(pGBKT7-NS4A)的AH109进行配合，寻找HCV NS4A与CAML相互作用的具体位点。将HCV NS4A真核表达载体转染入稳定转染CAML的293细胞，利用基因芯片技术检测二者相互作用后对细胞基因表达的影响。结果：筛选出在铺有X-α-gal的四缺培养基上能够生长并变成蓝色的真阳性菌落45个，其中包括29个CAML。对CAML基因成功克隆，在酵母细胞中回交验证了HCV NS4A与CAML的相互作用。构建了HCV NS4A及CAML的真核细胞表达载体，并利用免疫共沉淀技术在293细胞中验证了两者的相互作用。包含CAML蛋白氨基末端1～57位氨基酸的CAML不同缺失突变体及剪接体的酵母表达载体转染入酵母Y187后，均可以与转染pGBKT7-NS4A的AH109成功配合。基因芯片筛选结果提示转染HCV NS4A后的稳定转染了CAML基因的293细胞中共有48种基因的表达水平上调，36种基因的表达水平下调，其中与Rho蛋白信号转导相关基因6种。结论：在293细胞中HCV NS4A与CAML存在相互作用，其相互结合的位点位于CAML蛋白亲水的氨基末端1～57位氨基酸。二者相互作用可以使细胞内的一系列基因表达发生改变，其中包括与细胞凋亡相关的Rho蛋白信号转导相关基因。HCV NS4A可能通过与CAML相互作用对Rho GTPases信号通路活性产生影响，赋予细胞对凋亡的抵抗，并可能由此而参与丙型肝炎病毒感染慢性化的机制。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
引言  11-15
第1部分 酵母双杂交技术筛选人白细胞。DNA文库中HCV N54 A结合蛋白  15-35
  1.1 前言  15
  1.2 实验材料  15-17
  1.3 实验方法  17-30
    1.3.1 诱饵质粒在酵母菌株 AH109中的表达  17-24
    1.3.2 诱饵与白细胞文库的酵母配合  24-26
    1.3.3 配合效率分析  26
    1.3.4 阳性克隆的蓝白筛选  26
    1.3.5 提敢酵母质粒  26-27
    1.3.6 酵母质粒 PCR  27-28
    1.3.7 酵母质粒转化大肠杆菌 DH5a及酶切鉴定  28-29
    1.3.8 根据测序结果，在 Gen Bank中进行比对分析  29-30
  1.4 实验结果  30-33
    1.4.1 pG召KT7一N54A在酵母菌株 AH109中表达  30
    1.4.2 配合效率分析  30-31
    1.4.3 在四缺仪一a一gal培养基上生长的真阳性菌落  31
    1.4.4 筛选克隆PCR扩增鉴定结果  31-32
    1.4.5 筛选克隆Bgln酶切鉴定结果  32
    1.4.6 cDNA测序与同源性分析结果  32-33
  1.5 讨论  33-35
第2部分 cAML塞因及其不同剪接体的克隆及生物信息学分析  35-49
  2.1 前言  35
  2.2 实验材料  35
  2.3 实验方法  35-39
    2.3.1 cAML基因克隆  35-39
    2.3.2 CAML不同剪接体的克隆  39
    2.3 3 克隆产物生物信息学分析  39
  2.4 实验结果  39-46
    2.4.1 CAML基因及其不同剪接体 PCR扩增结果  39-40
    2.4.2 CAML及其不同剪接体克隆的酶切鉴定结果  40-41
    2.4.3 测序及生物信息学分析结果  41-46
  2.5 讨论  46-49
第3部分 HCV N54 A与 CAML相互作用的证实  49-60
  3.1 前言  49
  3.2 实验材料  49
  3.3 实验方法  49-54
    3.3.1 CAML基因酵母表达载体构建  49
    3.3.2 pGADT7一cAML转化酵母 Y187菌株  49-50
    3.3.3 回交验证实验  50
    3.3.4 HCVN54A及 CAML基因真核表达载体构建  50
    3.3.5 免疫共沉淀实验  50-54
  3.4 实验结果  54-57
    3.4.1 构建的CAML酵母表达载体  54-55
    3.4.2 回交验证实验结果  55-56
    3.4.3 构建的HCVN54A基因真核表达载体  56
    3.4.4 构建的CAML基因真核表达载体  56-57
    3.4.5 免疫共沉淀及westem Blotting检测结果  57
  3.5 讨论  57-60
第4部分 HCV N54A与 CAML相互作用位点的确定  60-68
  4.1 前言  60
  4.2 实验材料  60
  4.3 实验方法  60-62
    4.3.1 CAML基因不同剪接体酵母表达载体构建  60
    4.3.2 CAML基因不同缺失突变体酵母表达载体构建  60-61
    4.3.3 转化 CAML小同剪接体及缺失哭变体酵母表达载体至酵母 Y187菌株  61
    4.3.4 转化 HCVN54A酵母表达载体至酵母 AH109菌株  61
    4.3.5 配合试验  61-62
  4.4 实验结界  62-65
    4.4.1 CAML基因不同剪接体酵母表达载体酶切鉴定结果  62
    4.4.2 CAML基因不同缺失突变体酵母表达载体酶切鉴定结果  62-63
    4.4.3 HCY N54 A酵母表达载体酶切鉴定结果  63
    4.4.4 CAML基因不同剪接体与 HCV N54 A在酵母细胞中相互配合结果  63-64
    4.4.5 CAML基因不同缺失突变体与HCV N54 A在酵母细胞中相互配合结果  64-65
  4.5 讨论  65-68
第5部分 应用基由芯片技术探讨 Hcv N54 A与cAML相互作用对细胞基因表达的影响.  68-77
  5.1 前言  68
  5.2 实验材料  68
  5.3 实验方法  68-70
    5.3.1 CA向L稳定转染细胞株的筛选及建立二  68-69
    5.3.2 PCMv胭yc一N54 A转染至pe DNA3.l爪isA一CAMIJ稳定转染细胞株  69
    5.3.3 细胞m RNA提取  69
    5.3.4 探针标记及杂交  69
    5.3.5 检测与分析  69-70
  5.4 实验结果  70-73
    5.4.1 总 RNA及m RNA的定性、定量分析  70
    5.4.2 Hc女N53蛋白上调及下调表达基因  70-72
    5.4.3 与助。蛋白信号转导相关基因  72-73
  5.5 讨论  73-77
参考文献  77-82
结论  82-83
英文缩写词表  83-84
文献综述  84-100
  第1部分 酵母欢杂交系统的原理及研究进展  84-91
    1.1 酵母双杂交系统基本原理  84-85
    1.2 酵母双杂交系统的应用  85-86
    1.3 酵母双伞交系统的优点  86
    1.4 酵母双杂交系统的局限性  86-88
    1.5 酵母双杂交系统的进展  88-90
    1.6 参考文献  90-91
  第2部分 钙离子信号调节亲环素配体研究进展  91-100
    2.1 CAML的生物学特性  91
    2.2 CAML在钙离子信号转导中的作用  91-94
    2.3 目前已鉴定的CAML相互作用蛋白  94-97
    2.4 cAML对病毒感染的意义  97-98
    2.5 参考文献  98-100
博士在读期间发表论文  100-109
致谢  109

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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