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酿酒酵母高尔基体糖基化及生物学功能的研究

作　者: 周峻岗
导　师: 王鹏；祁庆生
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 酿酒酵母 糖基化 高尔基体 甘露糖基转移酶 细胞分裂 细胞凋亡 β-干扰素
分类号: Q932
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有无毒、容易培养、遗传背景清晰和对外源蛋白有糖基化修饰等优点，是理想的外源蛋白表达宿主。酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，酵母基因组数据库关于酵母基因组的详细注释（annotation）是研究糖基化酶的结构与功能之间的关系，寻找关键的结构域及阐明这些与膜相连的糖基化酶的拓扑学（topography）结构的重要工具。由于定位于酿酒酵母内质网和高尔基体的糖基化酶基因基本已被分离，有目的性的敲除这些酶将促进阐明糖基化与细胞功能的机制。在真核细胞中，分泌蛋白和定位蛋白经常被复杂的寡糖链修饰，糖蛋白中的寡糖在许多细胞识别过程中起着重要作用，如肿瘤转移、细胞粘附、病原体入侵和免疫反应等。另外，糖基化影响蛋白质的生物合成、折叠、抗原性、免疫原性及其在血浆中的半衰期。酿酒酵母蛋白N-糖基化和其他真核生物一样，首先发生在内质网中，N-连接的寡糖转移至新生肽的天冬酰胺上。转运到定位之前，N-糖链还经过高尔基体中进一步修饰加工至成熟的糖链结构。本课题主要研究了酵母高尔基体糖基化过程及N-糖链outer chain在细胞生命过程中的生物学功能。Mnn1p和Och1p是酿酒酵母高尔基体糖基化过程中的起始阶段的两个甘露糖基转移酶，Mnn1p参与N-糖链outer chain形成α1，3-甘露糖，Och1p则在核心糖链Man8GlcNAc2上加上一个α1，6-甘露糖，从而引发outer chain的α1，6-backbone的形成和N-糖链的过度甘露糖基化。利用Overlap extension PCR的方法，我们在体外构建了等位基因敲除DNA片段。通过敲除DNA片段上的同源序列与酵母基因组发生重组置换，敲除酵母N-糖基化过程中的甘露糖基转移酶基因MNN1和OCH1，构建了两株蛋白糖基化突变菌株：mnn1突变菌株和mnn1 och1突变菌株。为分析mnn1 och1突变菌株蛋白的糖基化形式，我们采用热柠檬酸抽提的方法，提取了酵母细胞壁的甘露糖蛋白；利用高甘露糖亲和柱concanavalin A-sepharose 4B亲和层析纯化抽提液中的甘露糖蛋白。利用糖酰胺酶PNGase F水解释放糖蛋白中的糖链；采用Shim-pack clc-NH2氨基柱Size-fractionation HPLC分析了2-氨基吡啶衍生后的糖链组份，结果表明，mnn1 och1突变菌株蛋白的糖链为单一组成，该组分的MALDI TOF／MS分子量鉴定为1794.66Da，与Man8GlcNAc2-PA的分子量相同。结果说明了MNN1和OCH1基因的敲除阻断了内质网核心糖链（ER core type glycan）在高尔基体中形成高聚合度甘露糖的outer chain，在mnn1 och1突变菌株中蛋白糖基化是单一的核心糖链结构，Man8GlcNAc2。糖蛋白不仅是细胞结构的重要组成部分，也是细胞生命活动的主要承担者之一。在mnn1 och1突变菌株中，蛋白糖基化在高尔基体阶段修饰受阻，通过突变菌株细胞形态及生化特征观察，发现高尔基体糖基化缺陷影响了细胞一些正常的活动；比较野生型和mnn1 och1突变菌株的生长曲线，发现突变菌株细胞生长速度明显减慢，菌体密度也不高；通过温度敏感性实验和台盼蓝染色（trypan blue dye staining）考察了高尔基体糖基化突变对细胞活力的影响。结果表明单个敲除基因MNN1并不影响细胞的生长表型，如果同时敲除MNN1和OCH1基因后，突变菌株的生长对温度变得敏感，这种温度敏感性的生长依赖于渗透压稳定剂。在mnn1 och1突变菌株中，细胞还表现一些细胞分裂的缺陷，而且渗透压稳定剂也不能抑制突变菌株细胞分裂缺陷。高尔基体糖基化突变影响了新生细胞壁的形成，导致子细胞不能正常地从母体细胞分离出来，细胞的不完全分裂造成了mnn1 och1突变菌株生长高度聚集，细胞堆积。另外，高尔基体糖基化缺陷也影响到分裂过程中细胞核的迁移，对mnn1 och1突变菌株细胞的细胞核DAPI染色发现一些芽孢没有细胞核。mnn1 och1突变使得N-糖链的完全丧失outer chain，因此减少了N-糖链的甘露糖磷酸化位点，这减弱细胞与细胞之间相同电荷的排斥作用，也破坏细胞表面的水化层，从而影响细胞的粘度，导致mnn1 och1细胞易堆积沉降。细胞凋亡（apoptosis）的生物学意义主要在于清除多余的、有害及衰老细胞，这一机制仍然保留在单细胞生物中。在哺乳动物和酵母中，蛋白整个糖基化过程缺陷，如ER糖基化起始阶段的基因突变或糖基化抑制剂，都诱导细胞的凋亡。本研究结果表明，N-连接糖链的不完整（高尔基体糖基化缺陷）足够引发酵母糖基化诱导的细胞凋亡。在trypan blue staining分析mnn1 och1突变菌细胞活力时发现，37℃培养时细胞大量死亡，显微观察发现部分死亡的细胞呈现与衰老细胞（ageing cell）相似的表征，如细胞表面疏松，皱褶。对mnn1 och1突变菌的凋亡形态学和生物化学特征进一步考察，结果显示，死亡的细胞中呈现细胞染色质浓缩（chromatin condensation），胞核碎化（nuclear fragmentation），磷脂酰丝氨酸外露（phosphatidylserine exposure）在细胞膜的外层，而细胞膜保持完整，这些细胞凋亡表型及生化的特征表明，mnn1 och1突变菌株细胞经历了程序性死亡过程（programme cell death）。活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）是酵母细胞凋亡关键的调控子，利用荧光探针二氢罗丹明123（dihydrorhodamine 123）检测mnn1 och1突变菌株细胞内的ROS水平，结果显示，在28℃和37℃培养的细胞中，ROS都出现不同程度的积累，说明高尔基体糖基化缺陷诱导的细胞凋亡是通过ROS途径进行调控。高尔基体糖基化缺陷可破坏酵母细胞壁的结构完整性，导致大量细胞坏死（necrosis），这一点通过mnn1 och1突变菌株增加了对50μg／ml的刚果红（Congo red）和细胞壁水解酶glucuronidase-lyticase敏感性以及1.0M的山梨醇（sorbitol）提高了细胞存活率中得到证实。人干扰素-β（HuIFN-β）是成纤维细胞受病毒感染或诱生剂诱导产生的细胞因子，广泛应用抗病毒，多发性硬化和肿瘤化疗。HuIFN-β是糖蛋白，在Asn80上有一个N-糖基化位点。将HuIFN-β基因导入酿酒酵母分泌型表达载体pYFD18，构建重组载体pYFD18-HuIFN，通过电击转化法，将重组载体分别导入w3031A（wild type）菌株。mnn1突变菌株及mnn1 och1突变菌株，筛选转化子并表达外源蛋白，利用Western blot检测酵母细胞内和发酵液中的HuIFN-β的表达，结果显示，HuIFN-β蛋白在胞内积累，都没有在α-factor信号肽的引导下分泌到发酵液中。而且野生型和mnn1 och1突变菌株的Western blot杂交条带大小相同，由此证明，β-干扰素在酿酒酵母中表达时，由于对酵母细胞的毒性，没有经过分泌途径进入高尔基体进行糖基化修饰而分泌到胞外，从而造成HuIFN-β以α-factor信号肽融合蛋白的形式在细胞内积累。

全文目录


摘要  9-12
ABSTRACT  12-16
缩写简表  16-18
第一章 绪论  18-41
  1.糖生物学研究进展  18-26
    1.1 糖生物学的发展历程  18-19
    1.2 糖生物学的研究现状和展望  19-20
    1.3 寡糖链的生物学功能  20-21
    1.4 糖蛋白与蛋白糖基化  21-24
    1.5 糖链分析方法的研究进展  24-26
  2.酿酒酵母糖基化的研究进展  26-33
    2.1 酿酒酵母在糖基化研究中的应用  26-27
    2.2 酿酒酵母的N-糖基化机制  27-33
    2.3 N-糖基化与酵母细胞形态  33
  3.酵母细胞凋亡  33-39
    3.1 动物细胞凋亡的特征  34
    3.2 单细胞生物的凋亡  34-35
    3.3 酿酒酵母细胞调亡  35-36
    3.4 酿酒酵母细胞调亡的研究意义  36-37
    3.5 酿酒酵母细胞凋亡的特征  37
    3.6 外源性诱导的酵母凋亡  37-38
    3.7 内源性诱导的酵母凋亡  38-39
    3.8 酵母细胞凋亡的研究展望  39
  4.本论文的研究工作  39-41
第二章 酿酒酵母糖基转移酶的基因敲除及糖基化分析  41-62
  1.材料与方法  42-51
    1.1 质粒与菌株  42
    1.2 分子克隆用酶及试剂  42
    1.3 培养基配方  42-43
    1.4 主要仪器和设备  43
    1.5 溶液及配置  43-44
    1.6 酵母DNA的快速提取法  44
    1.7 选择性标记基因和同源片段的扩增  44-45
    1.8 PCR扩增片段的回收  45
    1.9 URA3,HIS3基因的TA克隆  45
    1.10 大肠杆菌感受态细胞的制备  45-46
    1.11 连接产物的大肠杆菌转化  46
    1.12 质粒的SDS碱裂解法制备  46-47
    1.13 同源置换DNA片段的重叠延伸PCR的构建  47-48
    1.14 融合片段PCR产物的琼脂糖凝胶回收  48
    1.15 酿酒酵母电转化菌体的制备  48
    1.16 线性DNA的酿酒酵母电转化  48-49
    1.17 重组子的基因组PCR筛选  49
    1.18 酿酒酵母细胞壁蛋白的制备  49
    1.19 甘露糖蛋白的分离  49-50
    1.20 N-糖链的释放(release)和纯化  50
    1.21 N-糖链的2-氨基(2-aminopyridine)衍生  50-51
    1.22 吡啶化糖链的HPLC和MALDITOFMS分析  51
  2.结果与分析  51-59
    2.1 选择性标记基因及同源片段的扩增  51-52
    2.2 敲除线性DNA片段的构建  52-53
    2.3 酿酒酵母mnn1和mnn1och1突变菌株的构建  53-55
    2.4 酿酒酵母mnn1och1突变菌株的蛋白糖基化分析  55-59
  3.讨论  59-61
    3.1 Ochlp和Mnnlp基因对酿酒酵母N-糖基化的影响  59-60
    3.3 N-糖链的磷酸化  60
    3.3 突变菌株的应用前景  60-61
  4.本章小结  61-62
第三章 高尔基体糖基化缺陷对酵母细胞分裂的影响  62-76
  1.材料与方法  63-66
    1.1 菌株  63
    1.2 主要试剂  63
    1.3 培养基及溶液配置  63-64
    1.4 主要仪器和设备  64
    1.5 生长曲线测定  64
    1.6 细胞核染色  64
    1.7 温度敏感性试验  64-65
    1.8 台盼蓝(trypan blue)染色  65
    1.9 聚集态生长的细胞分离  65
    1.10 细胞的阿利新兰(alcian blue)染色  65-66
  2.结果与分析  66-73
    2.1 糖基化缺陷影响酿酒酵母的生长  66-67
    2.2 糖基化缺陷导致酿酒酵母细胞温度敏感  67-70
    2.3 糖基化缺陷影响酵母细胞分裂  70-72
    2.4 糖基化缺陷影响细胞表面负电荷密度  72-73
  3.讨论  73-75
    3.1 突变菌株缺陷与糖链的不完整性相关  73-74
    3.2 细胞壁破坏导致突变菌株温度敏感性  74-75
    3.3 糖基化影响细胞分裂  75
  4.本章小结  75-76
第四章 高尔基体糖基化缺陷与酵母细胞的死亡  76-95
  1.材料与方法  76-80
    1.1 菌株与培养基  77
    1.2 主要试剂和仪器  77
    1.3 溶液及配制  77
    1.4 细胞活力检测  77-78
    1.5 刚果红敏感性试验  78
    1.6 Glucuronidase-lyticase敏感性实验  78-79
    1.7 细胞核fragment检测  79
    1.8 细胞凋亡DNA ladder检测  79
    1.9 磷脂酰丝氨酸外露(PS exposure)的FITC-annexin V染色  79-80
    1.10 活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的测定  80
  2.结果与分析  80-89
    2.1 糖基化突变对酵母细胞活力的影响  80-82
    2.2 mnn1 och1突变菌株细胞染色质浓缩(Chromatin condensation)  82-84
    2.3 mnn1 och1突变菌株细胞膜磷脂酰丝氨酸外露  84-86
    2.4 糖基化突变导致细胞壁缺陷  86-88
    2.5 mnn1 och1突变菌株细胞内活性氧自由基的积累  88-89
  3.讨论  89-94
    3.1 细胞壁缺陷导致突变菌株细胞大量坏死  90
    3.2 内质网糖基化与细胞凋亡  90
    3.3 高尔基体糖基化与细胞凋亡  90-91
    3.4 酵母糖基化诱导的细胞凋亡调控机制  91-92
    3.5 ROS在酵母细胞凋亡中的作用  92
    3.6 酵母糖基化缺陷ROS积累机制  92-93
    3.7 糖基化与细胞凋亡的研究展望  93-94
  4.本章小结  94-95
第五章 干扰素在酿酒酵母中的克隆及表达  95-108
  1.材料与试剂  96-101
    1.1 载体和菌株  96
    1.2 试剂和主要仪器  96
    1.3 培养基  96-97
    1.4 溶液的配制  97-98
    1.5 目的基因的PCR扩增  98
    1.6 YFD18质粒的SDS碱裂解法制备  98
    1.7 目的基因与载体的限制性内切酶消化  98-99
    1.8 单酶切克隆载体的去磷酸化  99
    1.9 目的基因与载体的连接反应及转化  99
    1.10 重组质粒的制备及正向插入的筛选  99
    1.11 重组质粒酵母细胞的转化  99-100
    1.12 酵母中质粒DNA的提取  100
    1.13 发酵液的浓缩处理  100
    1.14 酵母胞内蛋白样品的制备  100
    1.15 Western-blot  100-101
    1.16 亲和层析纯化  101
  2.结果与分析  101-105
    2.1 干扰素-β基因的扩增及重组载体的构建  101-103
    2.2 酿酒表达菌株的构建  103-104
    2.3 干扰素的表达及western blot分析  104-105
  3.讨论  105-107
    3.1 mnn1 och1突变菌株在蛋白表达宿主菌中的应用  106
    3.2 HuIFN-β在酿洒酵母中的表达  106-107
  4.本章小结  107-108
References  108-124
附表  124-125
致谢  125-126
攻读学位期间发表的学术论文  126-127
学位论文评阅及答辩情况表  127-128
英文文章  128-166

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