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玫瑰无须鲃卵黄蛋白原和卵黄脂磷蛋白的纯化、鉴定、免疫分析和功能研究

作　者: 师晓栋
导　师: 张士璀
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: 玫瑰无须鳃卵黄蛋白原卵黄脂磷蛋白纯化免疫印迹凝血抑菌活性
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)是卵生动物中卵黄蛋白的前体，它是受激素调控的一种大分子磷脂糖蛋白。卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin, Lv)是卵黄蛋白原被卵母细胞吸收后水解的主要产物之一，它能为胚胎发育提供营养，但是其它方面的功能研究较少。玫瑰无须鲃在生态毒理研究方面有重要的应用价值，但是迄今对它的Vg和Lv的结构和功能方面的研究还未见报道。本文以17β-雌二醇诱导的成熟雌性玫瑰无须鲃的血浆和卵黄生成期的卵巢组织为实验材料，用Sephadex G-200葡聚糖凝胶过滤柱和DEAE-23纤维素弱阴离子交换柱首次从玫瑰无须鲃体内纯化到了卵黄蛋白原和卵黄脂磷蛋白，并进行了结构特性的研究。纯化的玫瑰无须鲃Vg在非变性胶电泳中分子量为450 kDa，SDS变性胶电泳中分子量为167 kDa，表明是由三个相同的亚基构成；而Lv非变性胶电泳分子量为370 kDa，是由125，110，76 kDa三个不同的亚基组成，这在硬骨鱼中是首次报道。非变性胶电泳后的凝胶分别利用苏丹黑B进行脂蛋白染色、高碘酸-希夫试剂进行糖蛋白染色和甲基绿进行磷蛋白染色，结果显示玫瑰无须鲃Vg是一种富含糖、脂、磷的蛋白，而Lv则是明显的糖脂蛋白，含磷较少。玫瑰无须鲃Vg氨基酸组成的测定表明其中Ala(10.58％)，Asp(8.46％)，Glu(10.30％)，Leu(11.23％)，Lys(7.22％)和Val(7.49％)含量较高，共计占总氨基酸的55.28％，His(2.76％)，Met(2.05％)和Tyr(3.43％)含量较低，与其它几种硬骨鱼十分类似。Lv的氨基酸分析结果显示Ala(12.19％)、Asp(7.56％)、Glu(11.63％)、Leu(11.05％)和Val(7.90％)含量较高，总和占氨基酸总重量的50.33％，His(2.54％)、Met(2.44％)和Tyr(2.39％)的含量较低，只占氨基酸总重量的7.37％。这些结果都证明纯化的两种蛋白为Vg和Lv。分别用纯化的玫瑰无须鲃Vg和Lv免疫小白鼠得到鼠源多克隆抗血清。用免疫双扩散的方法测得这两种蛋白抗血清的效价为1：32和1：64。Western blotting检测显示抗血清的特异性较好，还发现Vg和Lv之间有明显的免疫交叉反应性，说明两者具有相同的免疫原性。通过免疫双扩散还发现在通常条件下，Vg具有明显的雌特异性和种特异性，而Lv表现出明显的雌特异性、组织特异性和种特玫瑰无须鳃卵黄蛋白原和卵黄脂磷蛋自的纯化、鉴定、免疫分析和功能份卜究异性。利用人、草鱼、蟾蛛、鸡和兔的血红细胞对Vg和Lv进行血凝实验后发现它们都能特异性地对鸡血红细胞产生强烈的凝集作用，效价分别为29和28。这是首次报道硬骨鱼类的Vg和Lv具有特异性凝血活性。通过对凝集条件的研究发现，vg和Lv都是对热敏感、在中性条件下凝血效价较高、对SDs和琉基乙醇稳定的糖蛋白，但是Vg是一种典型的钙离子依赖性的糖蛋白，而Lv则表现不是很明显。此外通过凝集活性部位的研究证明了Vg和Lv的凝集活性与糖蛋白有关，Vg和Lv相应的抗原抗体复合物基本丧失了对鸡血红细胞的凝集能力。糖专一性抑制实验首次证明Vg和Lv的血凝活性能被D一葡萄糖、D一甘露糖和N一乙酞一D一葡萄糖胺所抑制，其中N一乙酞葡萄糖胺对Vg抑制作用最强，最小抑制浓度为16 mM;D一甘露糖对Lv抑制作用最强，最小抑制浓度为32 mM。利用单菌落计数法对Vg和Lv进行抑菌活性实验表明，Vg和Lv能对大肠杆菌、产气杆菌和金黄色葡萄球菌能产生明显的抑菌效果，这是首次报道鱼类vg和Lv具有广谱的抑菌作用，Vg和Lv的最小抑菌浓度分别为40陀/ml和80陀/ml。利用滤纸片法对敏感菌株一大肠杆菌的抑菌活性测定显示Vg具有更强的抑菌活性，在40“g/ml时仍能够显示出抑菌圈，而Lv在1 60“g/ml时抑菌圈消失。注射活体大肠杆菌到成熟的雄性玫瑰无须鳃体内，可以在感染的早期，在雄鱼血浆中利用western一blotting可以检测到有少量的Vg产生，首次发现Vg在硬骨鱼中也能由病原微生物诱导产生而发挥抑菌作用。

玫瑰无须鲃卵黄蛋白原和卵黄脂磷蛋白的纯化、鉴定、免疫分析和功能研究

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