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黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶分离纯化及其特性研究

作　者: 杨天赐
导　师: 程家安；莫建初
学　校: 浙江大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 黑翅土白蚁 内切-β-1 4-葡聚糖酶 β-葡萄糖苷酶 分离纯化 唾液腺
分类号: S433
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


在纤维素降解过程中，至少需要内切β-1，4-葡聚糖酶、外切β-1，4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶3种成分的共同作用，但白蚁的内源性纤维素酶只包括内切β-1，4-葡聚糖酶(Endo-β-1，4-glucanase，C_N或EGase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)2种成分，这两种成分由中肠上皮细胞和唾液腺分泌产生。低等白蚁后肠富含细菌、原生动物等共生微生物，它们分泌产生的纤维素酶，与白蚁内源性纤维素酶一道共同完成食物中纤维素类物质的降解。高等白蚁后肠缺乏原生动物，但其巢体上的共生真菌具丰富的纤维素酶，因此白蚁常通过取食巢体上的共生真菌来获得外源性纤维素酶，协助完成食物中纤维素的消化与吸收。 本文主要比较了几种白蚁纤维素酶活性差异，明确了纤维素酶在白蚁体内的分布途径。同时，借助离子交换技术从黑翅土白蚁体内分离出内切葡聚糖酶主要成分，初步掌握了该纯酶基本特性。同时，对黑翅土白蚁唾液腺的精细结构作了初步观察，为阐明白蚁纤维素酶分泌机制提供了一定的背景信息。 一、白蚁纤维素酶最适反应条件研究 黄胸散白蚁 Reticulitermes flaviceps C_N酶与羧甲基纤维素钠(Carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)反应的最适pH值范围在5.0-7.4之间，BG酶与Salicin反应的最适pH值为5.0-6.2，2种酶的活性均与pH值符合二次项曲线模型(Quadratic)。当pH分别为6.7(近乎中性)和5.2时，C_N和BG酶活性达到最大值，依次为1066.4U／头、664.0 U／头。C_N酶活性与反应温度符合线性模型，BG酶与温度间存在指数曲线关系。C_N和BG酶的活性大小均与底物浓度成显著的正相关。C_N酶活性与反应时间的关系符合幂曲线模型，BG酶活性与反应时间的关系则符合S形曲线模型。 二、不同栖境白蚁纤维素酶比较研究 通过不同品种间酶活性的比较，发现C_n酶活性最高的是土木两栖性的细颚散白蚁R.leptomandibularis工蚁，土柄性黑翘土白蚁Odontotermes formosanus工蚁的酶活性最低，两者酶活力之比达3.5以上。同时，测试的五种白蚁中，细颚散白蚁工蚁体内BG酶含量最高，其次为黑翅土白蚁，干木型平阳堆砂白蚁Cryptotermes pingyangensis的最低。 白蚁口腔中，平阳堆砂白蚁拟工蚁对CMC一入。:的降解能力最强;黑翅土白蚁工蚁头部B(;酶活性最大，其次为细颗散自蚁和黄胸散自蚁。 另外，细颗散白蚁前肠C、酶活性最尚，其次为平阳堆砂自蚁和黄胸散白蚁。除台湾乳白蚁改y，to决二，lns、f~、nL二外，上U它几种白蚁中，前肠的酶活均明显高于中肠和后肠。在台湾乳白蚁中，C、酶在中肠的活性最大。后肠C、酶活性较高的主要是黄胸散自蚁和细颗散白蚁，们两者间的差异并不{:三著。 对于B(;酶，在前肠，酶活性最大的是平阳堆砂白蚁和台湾乳白蚁。黑翅土白蚁肠道中BG酶的活性明显偏低，主要分布在中肠和后肠。而黄胸散白蚁和细颗散白蚁则主要集中在后肠，其中细颗散白蚁后肠酶的含量远高一于其它自蚁。三、黑翅土白蚁内切葡聚糖酶分离纯化 以l() mM阶15一日Cl(pH 7.5)为平衡缓冲液，利用l)tl()I:l()w液相层析系统阴离子交换柱UNOQ一l，分离得到黑翅土白蚁粗酶液的活力峰。将浓缩干燥后的白蚁纤维素酶纯酶液进行酶活专一性测定，发现它能够充分水解纤维素衍生物CMC，同时也有部分微弱的B(;酶活性，但无法水解底物州pC。测得纯化酶的活性分别比白蚁工蚁粗酶液提高了807.5倍和14.4倍，产率依次为65.6%和!.沙)。它对CMC和Sal iCi。专-活性分别为12.llt/mg和0.85U/l。g，前者是后者的l魂倍以匕。说明该纯酶液具有高度分解纤维素的能力，是种典型的内切葡聚糖酶。 经变性聚丙烯酞胺凝胶电泳，获得单一的蛋白条带。经Qu。ntityone软件包(4 .3.1)分析，黑翅土自蚁以;ase分子量大小为阳幼:、左右。利用l，[)Quest(7.1)软件包对该纯酶液2一DE凝胶图像进行分析，与51)5一PAGE测定结果基本一致。根据2一DE酶谱上的工EF分离结果，测得该纯酶等电点人小为6.4。四、黑翅土白蚁内切葡聚糖酶性质研究 C、酶活性与不同pH值符合对数曲线模型，根据白蚁肠腔组织中酸碱性的大小，选择使用6.2作为最适酶活反应pH值。在不同温度条件卜‘，反应温度与C、与CMC一Na活性符合三次项曲线模型(Cubic)。当温度达到51℃时，酶的活性最大。 根据底物浓度与反应速率间的关系，测得黑翅土白蚁氏ase动力学常数K，值为0.璐8 mg/m]，对应的Vm值为O.21mM/l。in。利用Edmil。降解法，测得该纯酶液N一末刁了/端前5个序列为:HPMLD，至少可以说明，黑翅土白蚁纯酶液是种内切葡聚糖酶同分异构体。五、黑翅土白蚁唾液腺精细结构观察 黑翅土白蚁的唾液腺呈半透明状，分布于口腔两侧，是白蚁消化酶分泌的主要场所，由一簇椭圆形腺泡和贮唾囊组成，{月邻腺泡依靠唾液腺上皮细胞的结缔组织盘曲在一起。根据黑翅土白蚁唾液腺胞浆囊泡和导管组织结构特点，可将腺泡分成3种分泌细胞类型(TI，T:，T=、)，其主要的功能可能与营养物质的消化吸收以及运输有关，从而维持白蚁体内水分和养分的平衡。

全文目录


致谢  5-7
中文摘要  7-10
缩略语  10-14
前言  14-17
第一部分 文献综述及技术路线  17-46
  第一章 纤维素酶降解纤维素的机理  18-27
    1 纤维素的降解  18-19
      1.1 纤维素结构  18-19
      1.2 纤维素的降解  19
    2 纤维素酶主要作用机制  19-24
      2.1 主要成分  19-20
      2.2 作用机理  20-21
      2.3 结构与功能  21-24
    3 纤维素酶的主要应用  24-27
  第二章 白蚁纤维素酶研究进展  27-41
    1 高等白蚁与低等白蚁的划分  28-30
    2 白蚁纤维素酶来源  30-35
      2.1 细菌类  31-32
      2.2 原生动物  32-33
      2.3 真菌类  33-34
      2.4 白蚁自身分泌产生  34-35
    3 白蚁纤维素酶的分离与纯化  35-36
    4 白蚁纤维素酶基因的克隆  36-39
    5 内切葡聚糖酶结构与功能预测  39-40
    6 结语与展望  40-41
  第三章 主要研究内容和技术路线  41-46
    1 研究内容  41
    2 研究拟解决的关键问题  41-42
    3 研究的技术路线  42-46
      3.1 白蚁纤维素酶最适反应条件研究  42-43
      3.2 不同栖境白蚁纤维素酶酶活差异比较  43
      3.3 白蚁纤维素酶的分离与纯化  43
      3.4 白蚁唾液腺超微结构观察  43-46
第二部分 不同白蚁纤维素酶活性差异  46-65
  第四章 白蚁纤维素酶最适反应条件研究  47-56
    1 材料与方法  47-49
      1.1 供试白蚁种类  47
      1.2 酶液提取  47-48
      1.3 酶活性测定  48
        1.3.1 内切-β-1，4-葡聚糖酶(简称C_x)测定  48
        1.3.2 β-葡萄糖苷酶(简称BG)测定  48
      1.4 纤维素酶最适反应条件的确定  48
        1.4.1 最适pH值的确定  48
        1.4.2 最适反应温度的确定  48
        1.4.3 最适底物浓度的确定  48
        1.4.4 最适反应时间的确定  48
      1.5 主要影响因子统计分析  48-49
    2 结果与分析  49-55
      2.1 最适pH值的确定  49-50
      2.2 最适反应温度的确定  50-52
      2.3 最适底物浓度的确定  52-53
      2.4 最适反应时间的测定  53-55
    3 结论与讨论  55-56
  第五章 不同栖境白蚁纤维素酶比较研究  56-65
    1 材料与方法  57-58
      1.1 材料  57
        1.1.1 供试白蚁  57
        1.1.2 化学试剂  57
      1.2 方法  57-58
        1.2.1 酶液制备  57-58
        1.2.2 酶活测定  58
    2 结果与分析  58-62
      2.1 纤维素酶对CMC-Na底物的专一性  58-60
      2.2 5种白蚁β-葡萄糖苷酶活性比较  60-62
    3 讨论  62-65
第三部分 黑翅土白蚁纤维素酶分离与纯化  65-86
  第六章 黑翅土白蚁内切葡聚糖酶分离与纯化  66-76
    1 材料与方法  67-70
      1.1 白蚁种类  67
      1.2 主要仪器设备  67-68
      1.3 化学试剂  68
      1.4 酶样品制备  68
      1.5 酶的纯化  68
      1.6 SDS-PAGE检测酶的纯度  68-69
      1.7 酶活测定  69
      1.8 双向凝胶电泳分析  69-70
    2 结果与分析  70-74
      2.1 内切葡聚糖酶纯化  70
      2.2 酶的纯度鉴定  70-72
      2.3 酶活性分析  72-73
      2.4 双向电泳分析  73-74
    3 讨论  74-76
  第七章 黑翅土白蚁内切葡聚糖酶性质研究  76-86
    1 材料与方法  76-77
      1.1 酶液来源  76
      1.2 化学试剂  76
      1.3 酶活最适反应条件研究  76-77
        1.3.1 酶促反应最适pH值  76
        1.3.2 酶促反应最适温度  76
        1.3.3 酶的动力学参数  76-77
      1.4 SDS-PAGE电泳  77
      1.5 N-末端测序  77
    2 结果与分析  77-85
      2.1 酶促反应最适pH值  77-79
      2.2 酶促反应最适温度  79
      2.3 酶的动力学参数  79-80
      2.4 N-末端氨基酸序列  80-85
    3 讨论  85-86
第四部分 白蚁纤维素酶分泌机制研究  86-93
  第八章 黑翅土白蚁唾液腺超微结构特征  87-93
    1 材料与方法  87-88
      1.1 供试白蚁  87-88
      1.2 方法  88
        1.2.1 透射电镜样品制备  88
        1.2.2 扫描电镜样品制备方法  88
    2 结果与分析  88-91
    3 讨论  91-93
第五部分 总结  93-100
  第九章 总讨论  94-100
参考文献  100-118
Abstract  118-122
附录一 攻读博士学位期间发表论文和获得奖励  122-123

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物虫害及其防治
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