学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

内质网应激反应（ERS）参与强噪声诱导豚鼠耳蜗细胞凋亡的实验研究

作　者: 薛秋红
导　师: 龚树生
学　校: 华中科技大学
专　业: 耳鼻咽喉科学
关键词: 噪声性耳聋细胞凋亡内质网应激 ABR TUNEL 免疫组化 Weatern Blot Grp78/Bip Caspase-12 P-JNK P-c-Jun CHOP3/Gadd153 Bcl-2
分类号: R764
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 294次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

细胞凋亡是一个复杂的病理生理过程,其过程归纳为两条途径:一是细胞外途径,即死亡受体途径。细胞外死亡信号蛋白与其受体结合,以激活Caspase-8为特征。二是细胞内途径,研究比较多是线粒体途径。通透性改变的线粒体,释放细胞色素C,激活Caspase-9为特征。近年来研究表明内质网(endoplasmic reticulum, ER)可能是细胞内诱导凋亡的一个新场所,因此提出内质网应激反应性凋亡通道。最近研究表明,细胞凋亡也是强噪声暴露诱导耳蜗细胞死亡的一种方式。本课题通过用中心频率4kHz的窄带噪声、给声强度120dB SPL、暴露时间4h的噪声刺激建立豚鼠噪声性耳聋(noise-induced hearing loss,NIHL)的动物模型,探讨噪声性耳聋是否存在细胞凋亡,以及内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress,ERS)是否参与了强噪声诱导耳蜗细胞凋亡以及其调控机制的研究,为进一步阐明噪声性耳聋的发病机制奠定基础,为将来治疗噪声性耳聋提供新的思路。本文共分为三个部分。第一部分噪声性耳聋动物模型的建立[目的]建立噪声性耳聋的动物模型,为下一步研究噪声性耳聋过程中是否存在细胞凋亡奠定基础。[方法]选用雄性白色豚鼠80只,随机分为实验组60只,对照组20只。实验组用中心频率4kHz的窄带噪声,给声强度为120dB SPL,噪声暴露时间为4h的噪声条件进行声暴露。健康对照组不接触噪声。分别在噪声暴露前及噪声暴露后1、4和14d后测动物ABR阈值。[结果]以Ⅲ波作为判断ABR阈值的指征。噪声暴露后1d、4d、14d组ABR平均阈值分别为90.00±3.33dB,64.50±6.85dB,60.00±6.67dB,对照组ABR平均阈值33.00±5.38dB。统计学分析各组之间差异有统计学意义(P<0.01),实验组与对照组ABR阈值相比差异有统计学意义(P<0.01),1d与4d、14d组差异有统计学意义(P<0.01),4d与14d组差异没有统计学意义(P>0.05)。[结论]本噪声刺激条件可以引起豚鼠永久性听阈位移,成功地建立了一种噪声性听力损害的动物模型,此模型可用于噪声性耳聋发病机制的研究。第二部分噪声性耳聋耳蜗细胞凋亡的研究[目的]强噪声诱发豚鼠耳蜗细胞凋亡的研究。[方法]通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(terminal- deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL),耳蜗基底膜铺片、Hoechst33342荧光染色及透射电镜观察Corti/s器及螺旋神经节细胞的超微结构来检测耳蜗凋亡细胞。[结果]光镜下,噪声暴露组,耳蜗Corti/s器、螺旋神经节及侧壁出现明显的TUNEL染色阳性反应,表现为细胞核呈棕黄色,并伴有核固缩及核不规则,每高倍视野以1d组最多,而正常对照组耳蜗Corti/s器、螺旋神经节及侧壁的染色极少见阳性细胞,阴性对照切片中未见阳性细胞。Corti/s器的TUNEL阳性细胞主要为外毛细胞及其周围的支持细胞,偶见内毛细胞。经统计学分析噪声暴露后1d、4d、14d组Corti/s器、螺旋神经节及侧壁的TUNEL染色平均吸光度值与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),1d组Corti/s器、螺旋神经节及侧壁的平均吸光度值与4d、14d组相比差异有统计学意义(P<0.01),4d组与14d组相比差异没有统计学意义(P>0.05)。耳蜗基底膜铺片、Hoechst33342荧光染色正常对照组毛细胞核为淡蓝色,细胞核大小一致,三排外毛细胞及一排内毛细胞排列整齐,噪声刺激后1d、4d、14d组Hoechst33342荧光染色的内、外毛细胞均呈现3种病理改变:①核肿胀;②核固缩;③核消失;即出现坏死、凋亡、缺失三种病理改变,以底回末端及第二回起始外毛细胞最多见;损伤的外毛细胞定量分析,在噪声暴露后1d、4d、14d总的趋势是缺失的外毛细胞逐渐增加,坏死和凋亡的细胞数逐渐减少,14d总的损伤外毛细胞细胞数(坏死、凋亡、缺失)明显上升。当比较凋亡和坏死细胞数在不同的时间点是不同的,在1d、4d组凋亡的细胞数明显多于坏死(P<0.05),14d组凋亡与坏死的细胞数没有明显差别(P>0.05)。通过透射电镜观察发现实验组1d耳蜗外毛细胞、螺旋神经节细胞均可见散在的早期凋亡特征性改变:细胞核染色质固缩、边集,在细胞核膜周边聚集成块,线粒体轻度增多,其他细胞器变化不大。健康对照组外毛细胞、螺旋神经节细胞未发现上述特征的细胞。[结论] 1、说明强噪声可以引起耳蜗细胞广泛性的凋亡。2、说明凋亡可能是强噪声引起豚鼠耳蜗细胞早期死亡的主要方式。3、说明凋亡过程至少可以持续到14天。第三部分内质网应激反应(ERS)参与噪声性耳聋的耳蜗细胞凋亡及其信号调控的机制研究[目的]通过检测Grp78/Bip(内质网伴侣蛋白,内质网应激反应的标志)的表达,Caspase-12的激活,JNK(C-Jun氨基末端激酶)信号通道的激活,CHOP/Gadd153(生长停滞、DNA损伤诱导的凋亡前期信号),Bcl-2蛋白的表达,来探讨内质网应激反应是否参与了强噪声诱导耳蜗细胞凋亡以及凋亡发生的调控机制。[方法]用免疫组化、Weatern Blot方法检测耳蜗细胞Grp78/Bip、Caspase-12、P-JNK、P-c-Jun、CHOP/Gadd153、Bcl-2蛋白的表达。[结果]免疫组化、Western Blot检测实验组Grp78/Bip蛋白明显高于正常对照组(P<0.01),实验组1d、4d、14d的蛋白表达量没有明显差异(P>0.05);光镜下Grp78/Bip免疫组织化学染色,噪声暴露后1d、4d、14d均可见Corti/s器、螺旋神经节及侧壁的细胞质上有染色程度不等的棕黄色颗粒分布,正常对照组染色弱阳性;Caspase-12蛋白含量在噪声刺激后迅速增高,1d、4d达到高峰,14d减少;Western Blot检测Caspase-12免疫组化染色,实验组Corti/s器、螺旋神经节及侧壁的细胞质上有染色程度不等的棕黄色颗粒分布,正常对照组表达阴性。免疫组织化学染色观察到实验组P-JNK、P-c-Jun有免疫反应阳性,定位于胞核,对照组未见阳性细胞。Western Blot检测P-JNK、P-c-Jun含量在噪声刺激后迅速增高并快速活化,1d、4d达到高峰,随后逐渐下降,但在14天仍然维持较高水平。免疫组化、Western Blot检测实验组CHOP/Gadd153表达明显高于对照组(P<0.01),实验组1d、4d、14d组CHOP/Gadd153表达没有差异(P>0.05);免疫组织化学观察到实验组CHOP/Gadd153在Corti/s器、螺旋神经节及侧壁有免疫反应阳性,定位于胞核,对照组表达阴性。Western Blot检测实验组Bcl-2蛋白无表达,而对照组Bcl-2的表达明显高于实验组(P<0.01);免疫组织化学染色,对照组Corti/s器、螺旋神经节及侧壁的细胞质上有染色程度不等的棕黄色颗粒分布,实验组表达阴性。[结论]1、实验组Grp78/Bip高表达,Caspase-12的活化说明强噪声刺激引起耳蜗组织细胞的内质网应激性凋亡。2、强噪声引起内质网应激性凋亡,可能通过下面三条途径激活:(1)通过激活Caspase-12,诱导细胞凋亡。(2)通过激活JNK信号通道,诱导细胞凋亡。(3)通过上调CHOP/Gadd153蛋白、下调Bcl-2蛋白的表达,诱导细胞凋亡。

全文目录

主要缩略词及中英文对照  4-6
中文摘要  6-11
英文摘要  11-17
前言  17-20
第一部分噪声性耳聋动物模型的建立  20-28
  材料与方法  20-21
  结果  21-23
  讨论  23-26
  小结  26-27
  参考文献  27-28
第二部分噪声性耳聋细胞凋亡的研究  28-45
  材料与方法  28-31
  结果  31-33
  讨论  33-37
  小结  37-39
  参考文献  39-41
  第二部分附图  41-45
第三部分内质网应激反应（ERS）参与噪声性耳聋的耳蜗细胞凋亡及其信号调控的机制研究  45-93
  材料与方法  45-49
  结果  49-57
  讨论  57-71
  小结  71-73
  参考文献  73-79
  第三部分附图  79-93
综述  93-100
附录  100-101
致谢  101

内质网应激反应（ERS）参与强噪声诱导豚鼠耳蜗细胞凋亡的实验研究

内容摘要

全文目录

相似论文