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苏氨酸对幼建鲤消化吸收能力和抗病力以及组织器官中蛋白质调控信号分子TOR表达的影响

作　者: 冯琳
导　师: 周小秋
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: Thr 幼建鲤 消化吸收 免疫 TOR基因表达量
分类号: S963
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究通过生长试验与原代细胞培养模型相结合,研究了18.0-74.7g幼建鲤不同体重阶段体成分以及组织器官中蛋白质合成调控信号分子TOR基因表达量变化规律,并在此基础上通过生长试验研究了不同水平Thr对幼建鲤生长性能、体成分沉积、血清、肝胰脏和肌肉中GOT.GPT酶活力、消化器官生长发育、消化酶和肠刷状缘酶活力及肌肉和前中后肠中TOR基因表达量的影响；通过生长试验和攻毒试验探索了不同水平的Thr对幼建鲤非特异性和特异性免疫功能的影响；通过细胞培养模型研究了不同水平的Thr对幼建鲤肠道上皮细胞增殖分化的影响；通过细胞培养模型结合同位素示踪技术研究了Thr对肠道蛋白质合成能力的影响及对蛋白质调控信号分子TOR基因表达量的影响。主要的研究内容及结果如下：1不同体重幼建鲤体成分以及组织器官中蛋白质合成调控信号分子TOR基因表达量变化规律研究选择体重相近(18.0±0.2g)的健康建鲤750尾进行生长试验。整个试验分为五个阶段,饲喂相同的日粮,每14天采样一次,用于测定幼建鲤体蛋白、体脂肪、体灰分及体水分的含量,考察血清、肌肉和肝胰脏中GOT和GPT活力以及血氨含量的变化情况,并测定肌肉、肝胰脏、头肾、后肾、脾脏、心脏和鳃中TOR相对表达量。研究发现：18.0—74.7g的幼建鲤随体重增加,水分含量显著下降(P<0.01),脂肪含量显著增加(P<0.01)；幼建鲤随体重增加体蛋白含量先显著增加(P<0.01),体重达31.4g以后达到稳定值；体灰分含量随体重增加显著下降(P<0.05),体重达40.1g后达到稳定值(P>0.05)。血氨浓度和肝胰脏GPT和GOT活力随体重的增加极显著升高(P<0.01),且与体重呈极显著的线性关系(Y1=1083.781+16.457X,R2=0.964；Y2=1249.597+16.190X,R2=0.947;Y3=2198.725+29.567X,R2=0.957,P<0.01,其中X为体重g),肌肉中的GPT和GOT活力也随体重增加极显著升高(P<0.01)；而血清中GOT活力随体重增加先极显著增加(P<0.01),体重达40.1g后极显著下降(P<0.01),GPT活力随体重增加先保持稳定值,体重达74.7g后极显著升高；18.0—74.7g的幼建鲤头肾、后肾、脾脏和鳃TOR的表达量随体重的增加呈线性增加(Y1=0.112+0.03X,R2=0.776,P<0.05;Y2=0.036+0.06X,R2=0.862, P＜0.05；Y3=0.255+0.002X,R2=0.770,P:0.05;Y4=0.132+0.002X,R2=0.774,P<0.05,其中X为体重g)；肌肉中TOR基因表达随体重增加而增加,并分别与体蛋白含量和肌肉蛋白含量呈显著的正相关(r1=+0.890；r2=+0.848,P<0.05)；而肝胰脏中TOR的表达量随体重增加呈显著的线性下降(Y=0.486-0.02X,R2=0.854,P<0.05)；心脏中TOR基因表达在体重达40.1g后显著(P<0.05)下降后达稳定值。研究结果说明20-80g幼建鲤随体重增加体蛋白质和脂肪含量增加,而体水分和灰分含量下降；随体重增加幼建鲤肝胰脏和肌肉中的氨基酸代谢增强；幼建鲤肌肉、脾脏、头肾、后肾、鳃、心脏和肝胰脏中均有蛋白质合成调控信号分子TOR的表达,肌肉、脾脏、头肾、后肾和鳃中TOR的表达量随体重增加而增加,而肝胰脏和心脏中TOR的表达量随体重增加而减少。2 Thr对幼建鲤生长性能、体成分沉积、血清、肝胰脏和肌肉中GOT、GPT酶活力及肌肉中TOR基因表达的影响研究选择体重相近(13.60±0.03g)的健康建鲤1050尾,平均分成7个处理,每处理150尾,每处理设3个重复,每个重复50尾,组间初始体重差异不显著(P>0.05)。7个处理组分别饲喂Thr水平为0.74、0.91、1.22、1.57、1.86、2.23和2.52%的饲料,考察不同水平Thr对幼建鲤生长性能、体成分沉积、血清、肝胰脏和肌肉中GOT、GPT活力及肌肉中TOR基因表达量的影响。结果发现：Thr能极显著提高幼建鲤特异性增长率和饲料效率(P<0.01),且建鲤特异性增长率和饲料效率分别与Thr含量呈极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)的二次回归关系(Y1=-0.3627x2+1.1765x+1.3705, R2=0.927；Y2=-5.8180x2+19.7028x+51.4993,R2=0.790,X代表Thr含量%),当Thr含量分别为1.62%和1.69%时,特异性增长率和饲料效率分别达到最佳值；Thr能极显著提高幼建鲤蛋白质沉积率和脂肪沉积率(P<0.01),但是对灰分的沉积率没有显著影响(P>0.05),蛋白质沉积率与Thr水平呈显著的二次回归关系(Y=-4.8344x2+15.2266x+21.3823,R2=0.820,P<0.05,X代表Thr含量%),当Thr含量为1.57%时,蛋白质沉积率达到最佳值；Thr能显著提高幼建鲤肝胰脏和肌肉中的GOT和GPT活力(P<0.05),且肝胰脏中的GOT和GPT活力分别与Thr含量呈显著或极显著的二次回归关系(Y1=-1632.7x2+5584.86x-578.64,R2=0.787,P <0.05:Y2=-586.98x2+1575.15x+2101.41,R2=0.961,P<0.01；Y3=-126.06x2+ 421.100x+703.604,R2=0.948,p<0.01:Y4=-174.89x2+564.995x+590.875,R2=0.813,P<0.05,X代表Thr含量%),当Thr含量分别为1.71、1.34、1.67和1.62%时,幼建鲤肝胰脏和肌肉中的GOT和GPT活力达到最大值；Thr对幼建鲤血氨浓度有显著的影响(P<0.01),且血氨浓度与日粮Thr含量呈显著的二次回归关系(Y=1349.88x2-4183.5x+4392.23,R2=0.908,P<0.01)；Thr对幼建鲤肌肉中的TOR基因表达量有显著的影响(P<0.05),当Thr含量为0.91%时,与缺乏组相比,肌肉中TOR基因表达量显著降低(P<0.05),饲料中Thr含量达到1.57%时肌肉中TOR基因表达显著增加,随Thr水平的增加肌肉TOR的表达量呈增加趋势,但是差异不显著(P<0.05)。对结果进一步分析发现：幼建鲤特异性增长率与摄食量、饲料效率、蛋白质沉积率和脂肪沉积率呈极显著(P<0.01)的正相关(r1=+0.976；r2=+0.883；r3=+0.923；r4=+0.932)。研究结果说明：Thr促进了幼建鲤的生长,生长的促进与摄食量、饲料效率、蛋白质沉积率和脂肪沉积率的提高有关；Thr能提高幼建鲤肌肉和肝胰脏中的氨基酸代谢,并显著影响肌肉中TOR的表达量；以特异性增长率为指标确定的幼建鲤(20-60g)Thr需要量为1.62%或5.07g/100gCP。3 Thr对幼建鲤消化器官生长发育、消化吸收能力及肠道中蛋白质合成调控信号分子TOR基因表达量的影响选择体重相近(13.60±0.03g)的健康建鲤1050尾,平均分成7个处理,每处理150尾,每处理设3个重复,每个重复50尾,组间初始体重差异不显著(P>0.05)。7个处理组分别饲喂Thr水平为0.74、0.91、1.22、1.57、1.86、2.23和2.52%的饲料,考察Thr对幼建鲤肝胰脏和肠道的生长发育、消化酶活力极肠道刷状缘酶活力、肠道微生物及肠道中蛋白质合成调控信号分子TOR基因表达的影响。研究发现：Thr能显著提高幼建鲤肝体指数和肝胰脏蛋白含量(P<0.01),显著提高幼建鲤肝胰脏中胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶的活力(P<0.01),肝胰脏糜蛋白酶和脂肪酶活力分别与Thr呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的二次相关(Y1=-4.0220x2+13.8680x-5.3260,R2=0.896,Y2=-189.38x2+624.789x+158.988,R2=0.915,X代表Thr含量%),当Thr含量分别为1.72和1.65%时,肝胰脏糜蛋白酶和脂肪酶的活力达到最高值；Thr能显著提高幼建鲤肠体指数、肠长指数、肠蛋白含量和前中后肠皱襞高度(P<0.01),显著提高肠道胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力(P<0.01,),肠道胰蛋白酶和脂肪酶活力与Thr含量呈显著(P<0.05)的二次相关(Y1=-0.7157x2+2.3674x+1.0750,R2=0.895,Y2=-140.57x2+454.669x+16.3032,R2=0.879,X代表Thr含量%),当Thr含量分别达1.65和1.62%时肠道胰蛋白酶和脂肪酶活力最高；Thr显著提高了肠道肌酸激酶和前中后肠Na+-K+ATP酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶的活力(P<0.01),且肠道肌酸激酶和前中后肠Na+-K+ATP酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶的活力与Thr含量呈显著或极显著的二次相关(Y1=-25.088x2+81.4732x-20.459,R2=0.894,P<0.05;Y2=-106.30x2+363.988x-68.602,R2= 0.945,P＜0.01;Y3=-127.01x2+430.508x-92.817,R2=0.943,P<0.01；Y4=-70.337x2+226.023x-31.678,R2=0.938,P＜0.01；Y5=-11.769x2+37.5870x-6.4615, R2=0.868,P＜0.05；Y6=-5.2309x2+16.5667x+1.5345,R2=0.924,P<0.01；Y7=-1.0622x2+3.5065x+0.9637,R2=0.883,P＜0.05；Y8=-22.440x2+71.1129x-9.7408,R2=0.9 71,P<0.01;Y9=-22.757x2+74.3064x+8.8138,R2=0.917,P<0.01; Y10=-25.413x2+81.2129x+15.3137,R2=0.910,P<0.01,X代表Thr含量%),当Thr含量分别为1.62、1.71、1.69、1.61、1.60、1.58、1.65、1.58、1.63、1.60%时,肠道肌酸激酶、前中后肠Na+-K+ATP酶、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶的活力达到最大；Thr显著影响了肠道乳酸杆菌、大肠杆菌和嗜水气单孢菌的数量(P<0.01),当Thr含量为1.57%时,肠道中乳酸杆菌数量达最大值,继续添加Thr乳酸杆菌数量呈下降趋势,而大肠杆菌和嗜水气单孢菌的数量变化与乳酸杆菌恰好相反；Thr显著影响了幼建鲤前中后肠的TOR基因表达量,肠蛋白含量与中肠TOR基因表达量呈极显著负相关(r=—0.917,P<0.01)。试验结果说明：Thr促进了幼建鲤肝胰脏的生长发育,促进了肝胰脏分泌消化酶的能力；Thr促进了肠道的生长发育,提高肠道消化蛋白质、脂肪和淀粉的能力,增加了幼建鲤对营养物质的吸收能力,同时优化了幼建鲤肠道微生物区系,增加了有益菌的数量,减少了有害菌的数量；Thr能显著影响幼建鲤前中后肠TOR的表达,Thr缺乏或过量TOR的基因表达均上升,在接近需要量时下降；根据消化酶活力和肠道刷状缘酶活力确定的幼建鲤(20-60g)Thr需要量为1.58-1.65%,与根据生长速度确定的需要量1.62%相近。4 Thr对鲤鱼肠上皮细胞增殖分化的影响采用单因子实验设计,以建鲤原代贴壁肠道长皮细胞体外培养模型考察不同Thr水平对鲤鱼IEC增殖和分化的影响。试验设计为6个处理,每个处理设4个重复。每个处理分别添加Thr浓度为：0、135、170、205、240和275mg／L。结果发现：Thr显著影响鲤鱼IEC的MTT OD值(P<0.05),随Thr浓度的增加,鲤鱼IEC的MTT OD显著增加(P<0.05),当Thr浓度为205mg／L时,MTT OD值最大,继续增加Thr浓度,MTT OD值显著下降(P<0.05)；Thr显著影响了鲤鱼IEC碱性磷酸酶、Na+-K+ATP酶活力及细胞蛋白含量(P<0.05),当Thr浓度为205mg/L时,鲤鱼IEC碱性磷酸酶、Na+-K+ATP酶活力分别达到最大值,继续增加Thr浓度,两种酶活力显著下降(P<0.05),细胞蛋白含量则随Thr浓度的增加而增加；Thr显著降低了培养液中蛋白质的消化量(P<0.05),Thr浓度为170mg/L时,蛋白质消耗量最低；Thr显著降低了培养液中乳酸脱氢酶活力(P<0.05),当Thr浓度为205 mg/L时,培养液中乳酸脱氢酶活力最低；Thr显著影响细胞中GOT和GPT活力,显著影响培养液中氨浓度(P<0.05),当Thr浓度为205 mg/L时,细胞中GOT活力显著高于其余各处理,而GPT活力则先显著增加(P<0.05),Thr浓度为170mg/L后又显著下降(P<0.05),Thr浓度为135mg/L时,培养液中的氨浓度显著下降(P<0.05),当Thr浓度为205mg/L时,氨浓度最低。研究结果说明：Thr促进了鲤鱼IEC的增殖和分化,促进了鲤鱼IEC的氨基酸代谢,保证了IEC结构和功能的正常。5 Thr对鲤鱼肠细胞蛋白合成率和TOR基因表达的影响本研究进行了3小试验。第一个小试验设2个处理组,研究Thr对肠细胞蛋白质合成的影响,每个处理组设10个重复,每个重复1孔,培养时间为240min。2个处理组分别含Thr 0mg／L和205mg/L。第二个小试验研究了205mg/L Thr对肠细胞TOR基因表达的影响,设2个处理组,分别含Thr Omg/L和205mg/L,每个处理设6个重复,培养时间30min。第三个小试验研究了205mg/L Thr对肠细胞TOR基因表达影响的时间效应,设5个处理组,设5个时间点,分别为15min,30min, 100min,170min和240min,每个时间点设6个重复。结果发现：Thr显著提高了鲤鱼肠道上皮细胞的蛋白质合成率(P<0.05),显著提高了幼建鲤IEC中TOR基因表达量(P<0.05),提高幅度达到55%；随着试验时间的延长,Thr显著提高了幼建鲤IEC中TOR的表达量(P<0.05),Thr作用30min后IEC中TOR的表达量显著增加(P<0.05),30—100min之间TOR的表达量保持稳定,当作用时间达到170分钟后IEC中TOR的表达量显著增加(P<0.05),之后保持稳定。结果说明Thr提高了幼建鲤IEC的蛋白质合成能力,蛋白质合成能力的增加与Thr提高IEC中蛋白质合成调控信号分子TOR的表达量有关；Thr对IEC中TOR的表达量随时间增加,表达量逐步增加,到170分钟达到平台值。6 Thr对幼建鲤非特异性和特异性免疫指标的影响选择体重相近(13.60±0.03g)的健康建鲤1050尾,平均分成7个处理,每处理150尾,每处理设3个重复,每个重复50尾,组间初始体重差异不显著(P>0.05)。7个处理组分别饲喂Thr水平为0.74、0.91、1.22、1.57、1.86、2.23和2.52%的饲料,生长试验60d结束以后用嗜水气单孢杆菌攻毒17d,考察Thr对幼建鲤免疫器官生长发育、疾病抵抗能力、非特异性免疫和特异性免疫功能的影响。结果发现：Thr显著提高了幼建鲤攻毒后成活率(P<0.01),当Thr含量为1.57%时幼建鲤攻读后成活率为100%；Thr显著提高了幼建生长试验期鲤头肾指数和脾体指数(P<0.01),显著提高其红细胞和白细胞数量(P<0.01)；Thr显著提高了幼建鲤白细胞吞噬率(P<0.01),且白细胞吞噬率与Thr含量呈极显著(P<0.01)的二次相关(Y=-26.408x2+88.0857x-21.261,R2=0.969),当Thr水平达1.67%时,白细胞吞噬率达最高；Thr极显著提高了幼建鲤IgM含量和抗嗜水气单孢菌抗体效价(P<0.01)当Thr含量为1.57%时,IgM含量最高,且抗嗜水气单孢菌抗体效价与Thr含量呈显著(P<0.05)的二次相关(Y=-54.651x2+179.867x-99.372,R2=0.969),当Thr含量为1.65%时嗜水气单孢菌抗体效价达到极值；Thr显著影响了幼建鲤血清补体C3和C4含量、溶菌酶活力、酸性磷酸酶活力、总铁结合力和凝集素效价(P<0.01),且血清补体C3和C4含量、酸性磷酸酶活力、总铁结合力呈显著(P<0.05)的二次相关(Y1=-105.55x2+352.445x-127.43,R2=0.800；Y2=-14.066x2+46.1787x-12.768,R2=0.805；Y3=-186.01x2+594.124x-168.16,R2=0.883；Y4=-31.992x2+99.9297x+22.3843,R2=0.793,),当Thr水平分别达1.67、1.64、1.60、1.56%时血清补体C3和C4含量、酸性磷酸酶活力、总铁结合力达到极值。对结果相关分析表明：幼建鲤攻毒后成活率与头肾重、脾脏重、白细胞吞噬率、血清补体C3含量、血清IgM水平呈极显著(P<0.01)的正相关(r1=+0.936,r2=+0.981,r3=+0.9841,r4=+0.932,r5=+0.934)。研究结果说明Thr提高了幼建鲤的疾病抵抗能力,疾病抵抗能力的提高与Thr提高幼建鲤免疫器官的生长发育、提高特异性和非特异性免疫能力有关。以免疫功能指标确定的Thr需要量为1.56-1.69%,与生长性能确定的需要量1.62%和以消化吸收功能指标确定的1.58-1.65%接近。综上所述：20-80g的幼建鲤幼建鲤肌肉、脾脏、头肾、后肾和鳃中TOR的表达量随体重增加而增加,而肝胰脏和心脏中TOR的表达量随体重增加而下降；Thr能够促进幼建鲤生长,提高体蛋白和体脂肪含量,体蛋白含量与肌肉中TOR基因表达有关；Thr了促进幼建鲤消化器官的生长发育,提高了消化酶的分泌能力和肠道吸收能力,肠蛋白含量与前中后肠的TOR基因表达量有关；Thr能够促进幼建鲤肠细胞的增殖和分化,提高蛋白合成力和TOR基因表达；Thr提高了幼建鲤的特异性和非特异性免疫力,非特异性免疫能力提高与其提高了对病原菌的识别、粘附调理、抑菌和溶菌能力有关。20-60g幼建鲤Thr的需要量为1.62%或5.07g/100gCP。

全文目录


摘要  4-11
ABSTRACT  11-20
缩略符号表  20-24
引言  24-26
第一章 文献综述  26-33
  1 不同生长阶段水生动物体组成和蛋白代谢酶活力的研究  26
  2 Thr对水生动物生长性能、体成分沉积以及蛋白代谢酶活力的影响  26-29
  3 Thr与水生动物消化吸收能力之间的关系  29-30
  4 Thr对水生动物特异性和非特异性免疫功能的影响  30-31
  5 Thr与水生动物蛋白质合成之间的关系及可能的作用途径  31-32
  6 存在的问题  32-33
第二章 研究的目的和意义  33-105
  第一节 幼建鲤体成分以及组织器官中蛋白质合成调控信号分子TOR基因表达量变化规律研究  34-46
    1 引言  34
    2 材料与方法  34-36
      2.1 试验鱼选择和设计  34-35
      2.2 试验饲料、配方组成  35-36
      2.3 试验条件和饲养管理  36
    3 测定指标  36-39
    4 数据处理和分析  39
    5 结果  39-44
    6 讨论  44-45
    7 小结  45-46
  第二节 Thr对幼建鲤生长性能、体成分沉积、血清、肝胰脏和肌肉中GOT、GPT活力及肌肉中TOR基因表达的影响研究  46-60
    1 引言  46
    2 材料与方法  46-48
      2.1 试验鱼选择及试验设计  46-47
      2.2 试验饲料及配方组成  47-48
      2.3 试验条件及饲养管理  48
    3 测定指标  48-50
    4 数据处理和分析  50
    5 结果  50-56
    6 讨论  56-58
    7 小结  58-60
  第三节 Thr对幼建鲤消化器官生长发育、消化吸收能力及肠道蛋白质合成调控信号分子TOR基因表达的影响  60-76
    1 引言  60
    2 材料与方法  60-61
    3 测定指标  61-62
    4 数据处理和分析  62
    5 结果  62-72
    6 讨论  72-74
    7 小结  74-76
  第四节 Thr对鲤鱼肠上皮细胞增殖分化的影响  76-87
    1 引言  76
    2 材料与方法  76-77
      2.1 试验设计  76-77
      2.2 试验鱼饲养  77
      2.3 细胞消化分离  77
      2.4 细胞接种培养  77
    3 细胞观察及指标测定  77-78
    4 数据处理和统计分析  78
    5 结果  78-84
    6 讨论  84-86
    7 结论  86-87
  第五节 Thr对鲤鱼肠细胞蛋白合成和TOR基因表达的影响  87-92
    1 引言  87
    2 材料与方法  87-88
      2.1 试验设计  87
      2.2 肠细胞培养的方法  87-88
    3 测定指标  88-89
    4 结果计算和统计分析  89
    5 结果  89-90
    6 讨论  90-91
    7 小结  91-92
  第六节 Thr对幼建鲤非特异性和特异性免疫指标的影响  92-105
    1 引言  92
    2 材料与方法  92-93
    3 测定指标  93
    4 数据处理和分析  93
    5 结果  93-101
    6 讨论  101-104
    7 小结  104-105
第四章 全文总结、创新点和研究展望  105-107
参考文献  107-120
致谢  120-121
攻读学位期间发表的学术论文目录  121

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