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吗啡引起的心肌线粒体保护中Akt的作用及其活化机制的研究

作　者: 徐菁蔓
导　师: 徐哲龙；田炜
学　校: 华北煤炭医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 吗啡 蛋白激酶B(PKB/Akt) Ser/Thr蛋白磷酸酶 第10号染色体上同源丢失的磷酸酶张力蛋白 活性氧 线粒体ATP依赖的钾离子通道
分类号: R541
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


背景:研究发现Akt在吗啡的抗缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）心脏保护中起重要作用,但Akt是否通过保护线粒体来介导吗啡的心脏保护作用以及吗啡诱发Akt活化的具体机制尚不完全清楚。目的:研究吗啡是否通过使Akt活化而减轻氧化应激诱发的线粒体损伤,并探讨吗啡诱导Akt活化的具体分子机制。方法:本实验选用大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞株作为研究对象。并用H2O2（600μM）造成H9c2细胞线粒体氧化应激损伤。采用四甲基罗丹明乙酯（tetramethyrhodamine ester, TMRE）进行荧光染色并通过激光扫描共聚焦显微镜成像法测定H9c2细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, ?Ψm）的变化,以判断线粒体膜通透性转移孔（mitochondrial-permeability transition pore, mPTP）的开放程度,进而确定线粒体的损伤程度。用免疫荧光法以及Western blot法检测磷酸化Akt、磷酸化第10号染色体上同源丢失的磷酸酶张力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）和总PTEN的改变。用丝/苏氨酸（Serine/Threonine, Ser/Thr）磷酸酶分析试剂盒检测蛋白磷酸酶2A（protein phosphatases 2A, PP2A）活性的变化。采用二氯荧光素双乙酸酯（dichlorodihydrofluorescein diacetate, H2DCFDA）进行荧光染色并用荧光分析仪测定H9c2细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量的改变。结果:1用H2O2（600μM）处理H9c2细胞20 min后,TMRE荧光强度明显减弱（47.1±4.1%）,与H2O2对照组相比,吗啡组（0.1μM）荧光减弱程度明显减低（83.8±2.6%）,提示吗啡减轻氧化应激引起的线粒体损伤。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K）的抑制剂渥曼青霉素（wortmannin, Wort, 1μM）或Akt抑制剂（Akt inhibitor, AKTI, 10μM）均可以抑制吗啡的保护作用（分别为66.8±13.2%,55.9±4.3%）,提示吗啡可能是通过激活Akt而发挥对心肌线粒体的保护作用。2与对照组相比,吗啡组（0.1μM）磷酸化Akt(Ser473)的表达明显增加（155.2±6.2%）,并且此作用被Wort（1μM）阻断（69.4±14.6%）,进一步表明Akt介导吗啡的心肌保护作用。3吗啡（0.1μM）不影响总PTEN和磷酸化PTEN( Ser308/ Thr382/383)的表达。另外吗啡（0.1μM）也不能使PTEN氧化。这些结果表明,PTEN可能不参与吗啡诱发的Akt活化过程。4与对照组相比,吗啡（0.1μM）（70.9±3.9%）明显抑制PP2A的活性。PP2A抑制剂冈田酸（okadaic acid, OA, 20 nM）明显增加Akt(Ser473)的磷酸化（170.3±20.9%）,并且通过减轻线粒体的氧化损伤而模拟吗啡的保护作用（66.0±36.6%）。这些结果均表明,吗啡可能通过抑制Ser/Thr磷酸酶而激活Akt。5与对照组（106.5±1.8%）相比,吗啡组（0.1μM）的ROS标记物二氯荧光黄（ dichlorofluorescein, DCF ）荧光强度明显增加（162.0±7.4%）,提示吗啡能够促进心肌细胞产生ROS。ROS清除剂2-巯基丙酰胺基乙酸（N-2-mercaptopropionyl glycine, MPG, 300μM）能够阻断吗啡（0.1μM）对PP2A活性的抑制作用（89.4±3.3%）,表明吗啡可能通过产生ROS进而抑制PP2A的活性。MPG（300μM）减弱吗啡（0.1μM）对线粒体氧化损伤的保护效应（67.3±6.1%）以及吗啡（0.1μM）诱发的Akt（Ser473）磷酸化增加效应（118.3±6.9%）。这些结果均表明,吗啡通过产生ROS使Ser/Thr磷酸酶失活,进而激活Akt。6吗啡（0.1μM）使DCF荧光强度增加的效应（162.0±7.4%）被线粒体ATP依赖的钾离子通道(mitochondrial KATP channel, mKATP)阻滞剂5羟葵酸盐（5-hydroxydecanoate , 5HD, 500μM）所逆转（117.1±3.0%）,提示吗啡通过使mKATP通道开放而促进ROS的生成。结论:1吗啡通过使Akt活化而减轻氧化应激诱发的线粒体损伤。2 PI3K/Akt信号途径的重要调节因子PTEN并没有在吗啡引起的Akt活化中发挥明显作用。3吗啡对Akt活性的上调作用归因于ROS对Ser/Thr磷酸酶的抑制。4 mKATP通道开放与吗啡诱发的ROS的产生有关。

全文目录


中文摘要  3-6
英文摘要  6-9
英文缩写  9-12
研究论文：吗啡引起的心肌线粒体保护中Akt 的作用及其活化机制的研究  12-57
  前言  12-14
  材料和方法  14-33
  结果  33-48
  讨论  48-51
  结论  51-52
  参考文献  52-57
附图  57-63
综述  63-77
  参考文献  72-77
致谢  77-78
个人简介  78

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病
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