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薯蓣皂苷对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用

作　者: 郭卫莉
导　师: 高卫真
学　校: 天津医科大学
专　业: 药理学
关键词: 薯蓣皂苷 Ox-LDL 内皮细胞凋亡 NO ET eNOS
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：研究薯蓣皂苷(Dioscin, Dio)对氧化低密度脂蛋白(Oxidized Low-density Lipoprotein, Ox-LDL)诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用,并探讨其作用机制。方法：1.原代培养牛胸主动脉内皮细胞采用胰酶消化刮取法原代培养牛胸主动脉内皮细胞(bovine aortic endothelial cells, BAECs)。绘制细胞生长曲线,利用内皮细胞Ⅷ因子相关抗原,采用免疫组化法进行内皮细胞鉴定。2.建立Ox-LDL损伤内皮细胞的模型,并加入薯蓣皂苷进行干预内皮细胞随机分为5组：①空白对照组(Control, C):加入含5%血清的培养液；②氧化低密度脂蛋白损伤组(Ox-LDL):加入终浓度为150μg/ml的Ox-LDL+含5%血清的培养液；③薯蓣皂苷低浓度干预组(DioL):预先加入终浓度为4.8μg/ml的薯蓣皂苷+150μg/ml的Ox-LDL+含5%血清的培养液；④薯蓣皂苷中浓度干预组(DioM):预先加入终浓度为12μg/ml的薯蓣皂苷+含150μg/ml的Ox-LDL+5%血清的培养液；⑤薯蓣皂苷高浓度干预组(DioH):预先加入终浓度为30μg/ml的薯蓣皂苷+150μg/ml的Ox-LDL+含5%血清的培养液。3.薯蓣皂苷对Ox-LDL诱导BAECs凋亡保护机制的研究光学显微镜观察细胞形态的变化；MTT法检测内皮细胞存活率；流式细胞术分析测定细胞凋亡率；硝酸还原酶法测定内皮细胞NO浓度；双抗体夹心法检测ET浓度；Western Blot测定内皮细胞eNOS的蛋白表达。结果：1.胰酶消化刮取法原代培养牛胸主动脉内皮细胞：细胞在种植2～4h后贴壁,呈圆形或小多角形,进而开始生长。5～7d后,细胞呈扁平多角形,呈铺路石状镶嵌式单层排列。核为圆形或椭圆形,1～2个核仁。核周有颗粒状内浆包绕,同时出现均质的外浆。Ⅷ因子相关抗原免疫组化法检测,胞浆内可见黄绿色颗粒,证明培养的细胞为内皮细胞。2.细胞形态学的变化：与空白对照组比较,Ox-LDL损伤组的内皮细胞圆缩,细胞间隙增宽,有少量细胞脱落悬浮于培养液中；与Ox-LDL损伤组比较,薯蓣皂苷各浓度干预组细胞损伤减轻,圆缩细胞减少,细胞间隙变窄。3.内皮细胞存活率：与空白对照组比较,Ox-LDL损伤组内皮细胞存活率显著降低(64.89±1.02vs100±0,P<0.01),并且呈现浓度和时间依赖性；与Ox-LDL损伤组比较,薯蓣皂苷各浓度干预组内皮细胞存活率显著升高(72.92±5.24vs64.89±1.02,83.89±4.41vs64.89±1.02,92.21±6.78vs64.89±1.02,P<0.01,P<0.05)。4.细胞凋亡率的变化：与空白对照组比较,Ox-LDL损伤组细胞凋亡率显著升高(49.6±10.44vs30.0±3.27,P<0.01),薯蓣皂苷各浓度干预组内皮细胞凋亡率下降(30.44±4.48vs49.6±10.44,36.5±8.29 vs49.6±10.44,46.7±10.76 vs49.6±10.44,P<0.01,P<0.05)。5.内皮细胞NO的浓度：与空白对照组比较,Ox-LDL损伤组内皮细胞NO的浓度显著降低(27.03±3.12vs59.46±16.19,P<0.01)；与Ox-LDL损伤组比较,薯蓣皂苷各浓度干预组内皮细胞NO的浓度显著升高(29.05±5.99vs27.03±3.12,38.94±6.34vs27.03±3.12,49.19±19.24vs27.03±3.12,P<0.01,P<0.05)。6.内皮细胞ET的浓度：与空白对照组比较,Ox-LDL损伤组内皮细胞ET的浓度升高(25.89±2.07vs16.93±1.64,P<0.05)；与Ox-LDL损伤组比较,薯蓣皂苷各浓度干预组内皮细胞ET的浓度降低(23.92±1.05vs25.89±2.07,21.30±1.42vs25.89±2.07,17.74±1.58vs25.89±2.07,P<0.05)。7.内皮细胞eNOS的蛋白表达：Western blot测定血管内皮细胞eNOS蛋白表达。与空白对照组比较,Ox-LDL损伤组eNOS蛋白表达显著降低；与Ox-LDL损伤组比较,薯蓣皂苷各浓度干预组eNOS蛋白表达显著增加。结论：1.Ox-LDL对血管内皮细胞的增殖有较强的抑制作用,并且呈现浓度和时间依赖性。在150μg/ml的浓度作用6h的条件下,适用于损伤模型。2.薯蓣皂苷能够使Ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡率降低,且呈一定的浓度依赖性。3.薯蓣皂苷对Ox-LDL诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用可能和通过减少ET的合成与分泌,提高eNOS的表达,从而使NO的合成与释放增加有关。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语  10-12
前言  12-14
  研究现状、成果  12-13
  研究目的、方法  13-14
一、牛胸主动脉内皮细胞的原代与传代培养  14-20
  1.1 对象和方法  14-17
    1.1.1 实验对象  14
    1.1.2 实验仪器  14
    1.1.3 实验试剂  14-15
    1.1.4 实验方法  15-17
  1.2 结果  17-19
    1.2.1 BAECs的形态学观察  17-19
    1.2.2 Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定  19
  1.3 小结  19-20
二、薯蓣皂苷对Ox-LDL诱导BAECs损伤的保护作用  20-26
  2.1 材料与方法  20-22
    2.1.1 实验材料  20
    2.1.2 实验仪器  20
    2.1.3 实验试剂  20
    2.1.4 实验方法  20-22
  2.2 结果  22-25
    2.2.1 Ox-LDL对BAECs存活率的影响  22-24
    2.2.2 薯蓣皂苷对BAECs增殖的影响  24
    2.2.3 薯蓣皂苷对Ox-LDL诱导BAECs损伤的保护作用  24-25
  2.3 小结  25-26
三、薯蓣皂苷对Ox-LDL诱导BAECs凋亡保护作用机制的研究  26-39
  3.1 材料与方法  26-34
    3.1.1 实验材料  26
    3.1.2 实验仪器  26
    3.1.3 实验试剂  26-27
    3.1.4 实验方法  27-34
  3.2 结果  34-38
    3.2.1 流式细胞术分析测定细胞凋亡率  34-35
    3.2.2 硝酸还原酶法测定NO浓度  35-36
    3.2.3 双抗体夹心法测定ET浓度  36-37
    3.2.4 Western blot测定eNOS蛋白表达  37-38
  3.3 小结  38-39
讨论  39-48
结论  48-49
参考文献  49-54
发表论文和参加科研情况说明  54-55
综述血管内皮细胞损伤机制的研究进展  55-64
  综述参考文献  61-64
致谢  64

薯蓣皂苷对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用

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