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前言恶性肿瘤己成为人类主要死亡因素,并有进一步增高的趋势。其中全球每年约有760,000人被诊断为胃癌。早期胃癌发病隐匿,或没有特殊的临床症状,所以,当胃癌因有症状而被诊断时,通常是胃癌晚期。胃癌的致病因素还不清楚,其中以下因素将增加胃癌的发病危险：年龄超过55岁,男性,高盐饮食,高硝酸盐类饮食,低维生素饮食,癌前病变,如恶性贫血、萎缩性胃炎、胃黏膜肠化生、李弗劳明综合征及有胃肠恶性肿瘤家族史等因素均会增加胃癌的发病风险；相反,粗粮饮食、多食蔬菜、水果、高纤维素饮食将降低胃癌发病率。胃癌的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗等,迄今为止,手术一直是胃癌的第一选择,化疗对胃癌的作用有限。胃癌的预后较差,胃癌严重威胁人类健康。所以,早期诊断,预防和治疗胃癌迫在眉睫。近年来,从传统中药和天然药物中寻找和提取防治肿瘤的有效成分已成为治疗肿瘤的希望和新途径。大蒜素是大蒜中主要生物活性成分的总称,为多种烯丙基有机硫化合物复合体,主要成分含50%-80%的二烯丙基三硫化合物(DADS)、20%-50%的二丙烯二硫化合物(DAS)。Chester J. Cavallito最早于1944年从实验室中分离提纯,现代药物化学研究证明,大蒜素中所特有的有机含硫化合物,对许多革兰阴性菌和革兰阳性菌以及真菌有很强的杀菌作用。近年来国内外的研究发现,长期摄入大蒜可以降低恶性肿瘤(尤其是胃肠道和口腔恶性肿瘤)的发生率,多项调查发现居民食用大蒜的量与胃癌的发病率、胃癌死亡率呈显著的负相关。动物实验和离体细胞试验中也证实大蒜及其提取成分具有良好的抗癌、防癌作用。关于大蒜素治疗胃癌机制方面的研究,目前认为大蒜素能阻断致癌物的合成,抑制致癌物的活化并有抗突变、抗畸变作用。本科室前期研究表明,大蒜素可以促进微管解聚,可提高促成熟因子(MPF)的重要成份cyclin B1在细胞内的表达并促进其向核内转移,使细胞周期阻滞于M期,即大蒜素治疗胃癌与大蒜素参与细胞周期调控有关。但有关大蒜素诱导胃癌细胞凋亡及其机制,尚有待深入探讨。顺铂是最广泛应用一线抗肿瘤的化疗药物。由于顺铂的临床疗效与其应用剂量相关,大剂量应用时的临床毒副作用较大,限制了其临床应用,其疗效仍有待于提高。提高顺铂的抗肿瘤疗效,是临床抗肿瘤治疗面临的实际问题。目前,在临床化疗中,常通过联合用药,以提高临床治疗疗效。那么,大蒜素联合顺铂能否发挥协同作用,对胃癌细胞有何影响,有待探讨。本课题以胃癌SGC-7901细胞为模型,研究大蒜素诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用,探讨大蒜素诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡机制,研究大蒜素与顺铂联合作用对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响及机制。材料与方法1、MTT法检测SGC-7901细胞活力。2、倒置显微镜下观察SGC-7901细胞形态。3、透射电镜检测大蒜素作用后SGC-7901细胞形态学变化。4、罗丹明123与碘化丙啶染色,荧光显微镜观察SGC-7901细胞形态学影响。5、膜联蛋白(Annexin-V)和碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(flow cytometry, FCM)定量检测细胞凋亡率。6、罗丹明123染色,流式细胞术检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential (ΔΨm))。7、细胞免疫组化及western-blot检测蛋白表达。8、real-time PCR检测mRNA表达。9、统计学处理：每次实验重复3次,数据以均数±标准差表示,采用SPSS13.0软件软件进行t检验及方差分析,P<0.05认为差别有统计学意义。实验结果1、MTT实验结果：作用相同时间,随着大蒜素浓度的增加对细胞活力的影响增加,大蒜素作用24小时,15μg/ml,对细胞生长无明显影响,是对照组的95.3±2.61%,120μg/ml,细胞活力是对照组的78.3±2.63%；相同浓度的大蒜素,随着作用时间延长大蒜素对细胞活力影响增加,大蒜素30μg/ml作用24h时,细胞活力是对照组的93.89±3.01%,大蒜素30μg/ml作用48h时,细胞活力是对照组的70。1±4.5%,作用72h,细胞活力是对照组的60.1±2.5%。与大蒜素15μg/ml作用48h时相比较,大蒜素30μg/ml作用48h时,细胞活力显著下降。提示大蒜素以时间、浓度依赖性模式抑制SGC-7901细胞活性。2、倒置显微镜观察,大蒜素组(大蒜素30μg/ml 48h)细胞体积变小,细胞呈圆形,死亡细胞明显增加。3、透射电镜观察：对照组SGC-7901细胞形态规整,细胞核较大,线粒体丰富,膜结构完整,可见细胞有大量纤毛；大蒜素组(大蒜素30μg/ml 48h)凋亡细胞体积变小,胞质浓缩,胞浆内空泡增多,染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状,线粒体肿胀,核膜不完整,出现凋亡小体。4、罗丹明123与碘化丙啶染色,荧光显微镜观察,大蒜素30μg/ml作用48h,Rh123染色的荧光强度低,细胞片段化,细胞核PI染色,荧光强度增加,表明细胞无活力,而对照组细胞未表现出上述特点。5、膜联蛋白(Annexin-V)／碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(flow cytometry, FCM)定量检测细胞凋亡率,对照组细胞凋亡率为2.48±0.5%,大蒜素组(大蒜素30μg/ml 48h)为15.14±1.5%,两组相比较,差异有统计学意义(P<0.01)。6、线粒体跨膜电位(△Ψm)检测：对照组为90.81±3.48%,大蒜素30μg/ml作用48h组为47.75±5.41%,与对照组相比较,线粒体膜电位下降。7、细胞免疫组化和western blot结果显示,与对照组比较,大蒜素30μg/ml作用48h,细胞Caspase 3, Bax, Cytochrome c, Fas和Caspase 8蛋白表达均增加。8、Real-time PCR检测表明：与对照组比较,大蒜素30μg/ml作用48h, Caspase 3 mRNA、Bax mRNA, Cytochrome c mRNA和Fas mRNA表达增加。9、大蒜素与顺铂联合用药组,MTT实验结果：作用24h,细胞活力是对照组的81.12±3.58%,作用48h,细胞活力是对照组的42.33±3.86%,作用72h,细胞活力是对照组的22.12±4.12%,联合用药在抑制细胞活力方面发挥了协同作用,与对照组,单用大蒜素组,单用顺铂组相比较,差异具有统计学意义。10、罗丹明123与碘化丙啶染色,荧光显微镜观察,联合作用组细胞片段化,细胞核PI染色,荧光强度增加显著,表明细胞无活力,而对照组细胞未表现出上述特点。11、膜联蛋白(Annexin-V)／碘化丙啶(PI)染色流式细胞术检测细胞凋亡率,联合用药组(大蒜素30μg/ml,顺铂2μg/ml 48h)为38.3±0.5%,对照组细胞凋亡率为2.48±0.5%,大蒜素组(大蒜素30μg/ml 48h)为15.14±1.5%,顺铂组(顺铂2μg/ml 48h)细胞凋亡率为30.96±0.5%,联合用药在诱导细胞凋亡方面发挥了协同作用,与对照组,大蒜素组,顺铂组相比较,差异具有统计学意义。12、线粒体跨膜电位(△Ψm)检测：联合用药组作用48h为55.26±4.88%,对照组为90.81±3.48%,大蒜素30μg/ml作用48h为47.75±5.41%,顺铂组2μg/ml作用48h为71.88±4.26%,与对照组相比较,线粒体膜电位下降。13、细胞免疫组化和western blot结果显示,与对照组比较,联合用药组作用48,细胞Caspase 3, Bax, Cytochrome c, Fas和Caspase 8蛋白表达均增加。结论1、大蒜素能够诱导胃癌细胞凋亡。2、大蒜素可以通过促进Bax、Cytochrome c的表达,降低线粒体膜电位发生,活化Caspase 3,激活内源性线粒体凋亡信号转导途径引起凋亡；3、大蒜素能够促进Fas, Caspase 8表达,诱导胃癌细胞凋亡,即死亡受体通路也参与了大蒜素诱导胃癌细胞凋亡4、大蒜素联合顺铂在诱导胃癌细胞凋亡方面发挥了协同作用,与对照组,大蒜素单独作用组,顺铂单独作用组相比较,提高了胃癌细胞凋亡率。5、线粒体通路和死亡受体通路均参与了大蒜素联合顺铂诱导胃癌细胞的凋亡过程,大蒜素联合顺铂在诱导胃癌细胞凋亡方面发挥协同作用,其机制可能与线粒体通路和死亡受体通路均有关。
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