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聚半乳糖醛酸酶的酶学性质及产物分析

作　者: 王志伟
导　师: 江晓路
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工与贮藏工程
关键词: Aspergillus niger M-8 聚半乳糖醛酸酶 酶学性质 果胶低聚糖
分类号: TS201.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 207次
引　用: 3次
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内容摘要


通过选择性培养方法筛选出一株产聚半乳糖醛酸酶的菌株,优化了产酶培养基和产酶条件,提高了菌株产聚半乳糖醛酸酶的能力,重点对聚半乳糖醛酸酶的基本酶学特性以及酶解产物——果胶低聚糖进行了初步分析研究。主要研究结果如下:⑴菌株筛选与产酶条件从腐烂的葡萄干样品中分离筛选出一株产聚半乳糖醛酸酶的菌株M-8,经鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。通过单因子实验和正交实验确定了最适产酶的发酵培养基组成(%:果胶0.7,NaNO3 0.1,MgSO4 0.02,FeSO4 0.001,KH2PO4 0.03,豆粉1.0,马铃薯20);确定了最适产酶的培养条件(温度为28℃,初始pH为7.0,装液量为250mL三角瓶中装入50mL液体培养基,摇瓶转速为180rpm,接种量7%v/v)。在此培养条件下,利用优化的培养基进行发酵培养48h达到产聚半乳糖醛酸酶高峰,酶活力为964 U/mL。⑵聚半乳糖醛酸酶的酶学性质用2.5倍丙酮对无细胞发酵液进行沉淀,经FPLC液相层析系统对此酶进行分离纯化,SDS-PAGE电泳确定酶的分子量为68.8KDa。该酶的最适反应温度为50℃,在40~60℃范围内酶活力维持在较高的水平;该酶在35℃时比较稳定,处理酶液120min,酶活保留90.5%,在50℃、60℃下分别反应60min和10min,酶活仅保留30.3%和16.1%。酶的最适反应pH为3.2,在pH2.4~5.2的范围内,酶活力可保持80%以上。金属离子Zn2+和Ca2+对酶活有较为显著的促进作用,Cu2+、Pb2+、Hg2+和Ag+对酶活具有较强的抑制作用。该酶的米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为2.04×10-3g/L和1.567×103μg/min。该酶也具有较好的贮存稳定性。⑶酶解产物的初步分析利用聚半乳糖醛酸酶降解桔子果胶,通过乙醇分级沉淀来获得果胶低聚糖,低聚糖的总得率为87.2%。对低聚糖组分采用电离喷雾质谱(ESI-MS)进行分析。2倍乙醇沉淀得到的低聚糖组分当中,低聚糖片断包括二糖至七糖,其中由3个半乳糖醛酸残基和1个酯化的半乳糖醛酸残基组成的四糖所占的比例较高;4倍乙醇沉淀得到的低聚糖组分当中,低聚糖片断包括二糖至五糖,由3个半乳糖醛酸残基组成的三糖所占的比例较高。苹果果胶和甜菜果胶经酶解的产物当中,由2个半乳糖醛酸残基组成的二糖占有相当大的比例。目前,国内对于果胶低聚糖组成及结构的研究还未见报道。本文利用菌株Aspergillus niger M-8所产生的聚半乳糖醛酸酶降解果胶,获得均一性较好的果胶低聚糖片断,在分子学基础上对其进行了初步分析,为进一步研究果胶低聚糖的生物学活性提供帮助。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
0 前言  9-28
  0.1 概述  9-11
  0.2 聚半乳糖醛酸酶的研究进展  11-21
    0.2.1 聚半乳糖醛酸酶的来源  11-12
    0.2.2 产聚半乳糖醛酸酶菌种的选育  12-13
    0.2.3 聚半乳糖醛酸酶的分离纯化  13-16
    0.2.4 酶反应最适pH及pH稳定性  16
    0.2.5 酶反应最适温度及热稳定性  16-17
    0.2.6 金属离子及抑制剂对聚半乳糖醛酸酶的影响  17
    0.2.7 聚半乳糖醛酸酶的分子生物学研究进展  17-19
    0.2.8 聚半乳糖醛酸酶在工业中的应用  19-21
  0.3 果胶组成及结构的研究进展  21-27
    0.3.1 果胶的结构和化学组成  22-23
    0.3.2 果胶低聚糖组成与结构的研究方法  23-25
    0.3.3 果胶低聚糖的生物学活性研究  25-27
  0.4 本研究的主要内容及目标  27-28
1 产聚半乳糖醛酸酶菌株的筛选和鉴定  28-35
  1.1 引言  28-29
  1.2 实验材料  29-30
  1.3 实验方法  30-31
  1.4 结果与讨论  31-33
    1.4.1 菌株筛选结果  31-32
    1.4.2 菌株M-8 的生物学性状与鉴定  32-33
  1.5 小结  33-35
2 Aspergillus niger M-8 的产酶条件优化  35-50
  2.1 引言  35-36
  2.2 实验材料  36-37
  2.3 实验方法  37-39
  2.4 结果与分析  39-48
    2.4.1 发酵产酶培养基的优化  39-43
    2.4.2 发酵产酶条件的优化  43-47
    2.4.3 生长曲线和产酶曲线的测定  47
    2.4.4 菌株产酶性状稳定性实验  47-48
  2.5 小结  48-50
3 聚半乳糖醛酸酶的分离纯化及酶学性质  50-67
  3.1 引言  50-51
  3.2 实验材料  51-52
  3.3 实验方法  52-55
  3.4 结果与分析  55-65
    3.4.1 酶的制备与分离纯化  55-58
    3.4.2 酶的电泳及分子量的确定  58-59
    3.4.3 酶的最适作用pH  59-60
    3.4.4 酶的pH 稳定性  60-61
    3.4.5 温度对酶活性及稳定性的影响  61-63
    3.4.6 酶动力学曲线及米氏常数的测定  63-64
    3.4.7 金属离子对酶活性的影响  64
    3.4.8 酶的贮存稳定性实验  64-65
  3.5 小结  65-67
4 果胶低聚糖的酶解制备与组成分析  67-76
  4.1 引言  67-68
  4.2 实验材料  68-69
  4.3 实验方法  69-70
  4.4 结果与分析  70-72
    4.4.1 果胶低聚糖的酶解制备  70-71
    4.4.2 低聚糖组分的初步分析  71-72
  4.5 小结  72-76
参考文献  76-85
结论  85-87
硕士期间发表的论文情况  87-88
致谢  88

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品微生物学
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