学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

油菜及小繁缕中与核盘菌毒性因子PG互作蛋白编码基因的筛选及其特征研究

作　者: 杨恩东
导　师: 杨清；王心宇
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 油菜小繁缕菌核病(Sclerotinia stem rot) 多聚半乳糖醛酸酶酵母双杂交
分类号: S435.654
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 28次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

油菜(Brassica napus)是重要的经济作物和主要的油料作物,在国民经济和农业生产中具有重要作用,而由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病则是我国油菜生产上的重要病害,目前还没有高抗或免疫的抗病品种。研究核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)与油菜等宿主互作的分子机制,寻找一些致病或抗病相关基因,无疑对菌核病的防治有着重要意义。本研究利用酵母双杂交技术(Y2H),建立了核盘菌诱导的油菜品系RS-1(对核盘菌有部分抗性)及其田间杂草小繁缕(Stellaria apetala Ucria,经接种鉴定对核盘菌免疫)的cDNA文库,以核盘菌毒性因子PG为诱饵蛋白在上述2个文库中筛选到一些互作蛋白,并结合半定量PCR,实时PCR,瞬时表达及亚细胞定位等技术对一些基因进行了初步分析。研究的主要结果如下:一、根据加拿大学者Li等(Li et al.,2004)在NCBI中提交的PG基因序列ORF两端保守区设计引物,通过RT-PCR的方法克隆到了菌核病毒性因子PG基因sspg1d(NCBI编号为AF501307),并将其克隆到酵母载体pGBKT7上,构建成诱饵载体PG/pGBKT7,为进一步的双杂交筛选奠定了基础;二、分别以油菜和油菜田间杂草小繁缕为材料,构建成了核盘菌诱导的cDNA文库,并且利用构建好的诱饵进行筛选,在油菜中筛选到1个与PG互作的含C2结构域蛋白因子(命名为IPG-1),C2结构域可与钙离子结合,暗示PG信号转导与钙离子有关。在小繁缕cDNA文库中筛选到1个膜蛋白(命名为XFL-PG-1)及其它6个与抗逆及细胞凋亡等有关的基因,为菌核病的分子防治提供了依据:三、利用半定量RT-PCR,实时PCR技术分析了IPG-1在mRNA水平上的表达差异,发现IPG-1受核盘菌诱导后表达量迅速增加,而且受诱导后在叶片中表达量最多,茎中次之,花中最少;酵母双杂交实验证明IPG-1中与PG互作密切相关的部位位于该基因编码蛋白的C端;瞬时表达研究表明IPG-1编码产物分布于细胞质和膜上,而XFL-PG-1则分布于细胞膜上;四、分别构建了IPG-1的过表达载体、RNA干扰载体,为研究该基因的功能奠定了基础;并且构建了PG和IPG-1的原核表达载体PG-pGEX4T,IPG-1-pET30a,以便进一步研究二者在体外的互作关系;通过RACE和RT-PCR克隆了IPG-1在拟南芥中的同源基因及核盘菌中致病过程中的一个转录因子PAC1基因的片段,构建了它们的干扰载体AIPG-i-pART27,PAC1-i-pART27和PG-i-pART27,用于转基因研究。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
第一章文献综述  12-32
  1.1 核盘菌与菌核病  12-15
    1.1.1 核盘菌的分类地位及生物学特性  12
    1.1.2 核盘菌所致菌核病的症状及危害  12-13
    1.1.3 核盘菌的致病机理  13-15
    1.1.4 菌核病的防治情况及研究意义  15
  1.2 植物抗病防御的病理生理  15-20
    1.2.1 过敏性反应(以下简称HR)  16
    1.2.2 系统获得性抗性(system acquired resistance SAR)  16-17
    1.2.3 植物的非宿主抗性——宿主与病原物的互作机制  17-19
    1.2.4 植物抗病反应的信号传导途径  19-20
  1.3 基因全长的克隆方法  20-22
    1.3.1 基因文库的筛选  21
    1.3.2 3'RACE or 5'RACE(rapid amplification of cDNA ends),即cDNA末端快速扩增法  21
    1.3.3 计算机杂交(computer hybridization)  21-22
  1.4 酵母双杂交技术  22-28
    1.4.1 基本原理  22-23
    1.4.2 优缺点  23-24
    1.4.3 酵母双杂交系统的进一步发展  24-26
    1.4.4 酵母双杂交系统的广泛应用  26-27
    1.4.5 MATCHMAKER GAL4 TWO-Hybrid System3简介  27-28
  1.5 绿色荧光蛋白标记  28-31
    1.5.1 绿色荧光蛋白研究现状  28-29
    1.5.2 绿色荧光蛋白的应用优点  29
    1.5.3 绿色荧光蛋白应用  29-31
  1.6 本研究的目的和意义  31-32
第二章材料与方法  32-51
  2.1 实验材料  32-34
    2.1.1 植物材料  32
    2.1.2 菌株与质粒  32
    2.1.3 酶与各种生化试剂  32-33
    2.1.4 试验用的引物和寡核苷酸  33-34
  2.2 试验方法  34-51
    2.2.1 不同RNA的提取及纯化  34-36
    2.2.2 PG基因的克隆及诱饵载体PG-pGBKT7的构建  36-38
    2.2.3 油菜及小繁缕cDNA文库的构建和筛选  38-45
    2.2.4 5'RACE步骤  45-46
    2.2.5 与PG互作基因IPG-1全长的获得  46-47
    2.2.6 RT-PCR及Real Time PCR  47-48
    2.2.7 载体的构建  48
    2.2.8 酵母双杂交作用的进一步确认  48
    2.2.9 瞬时表达  48-51
第三章结果与分析  51-70
  3.1 核盘菌PG基因的克隆及诱饵载体PG-pGBKT7的构建  51-52
    3.1.1 核盘菌PG基因的克隆  51-52
    3.1.2 诱饵载体PG-pGBKT7的构建  52
  3.2 油菜cDNA文库的构建及筛选  52-57
    3.2.1 核盘菌接种诱导后油菜总RNA的完整性  52-53
    3.2.2 油菜cDNA文库的构建  53-54
    3.2.3 油菜cDNA文库的质量  54-57
  3.3 IPG-1特征的研究  57-61
    3.3.1 IPG-1的序列分析  57
    3.3.2 IPG-1的半定量RT-PCR分析及Real TimePCR分析结果  57-58
    3.3.3 IPG-1的亚细胞定位结果  58-59
    3.3.4 IPG-1与PG酵母双杂交相互作用的进一步验证  59-61
  3.4 小繁缕cDNA文库的构建和筛选  61-66
    3.4.1 小繁缕总RNA的完整性  61-62
    3.4.2 经核盘菌诱导的小繁缕cDNA文库的构建  62
    3.4.3 诱饵PG对小繁缕cDNA文库的筛选得到阳性克隆(XEL-PG-1)  62-63
    3.4.4 XFL-PG-1的特征研究  63-66
  3.5 载体的构建  66-70
    3.5.1 PAC-1基因的3'端序列的克隆及其RNAi载体的构建  66-67
    3.5.2 PG基因RNAi载体的构建  67-68
    3.5.3 IPG-1基因及其拟南芥同源基因AIPG的RNAi载体的构建  68-69
    3.5.3 IPG-1基因植物表达载体,原核表达载体的构建  69-70
第四章讨论与结论  70-74
  4.1 讨论  70-72
    4.1.1 关于利用核盘菌毒性因子PG作为诱饵利用酵母双杂交筛选互作基因  70-71
    4.1.2 关于目的基因的特征研究  71-72
    4.1.3 关于表达载体的构建  72
  4.2 结论  72-74
参考文献  74-79
附录:培养基、溶液的配制及载体图谱  79-86
攻读硕士学位期间已发表和待发表的论文  86-88
致谢  88

油菜及小繁缕中与核盘菌毒性因子PG互作蛋白编码基因的筛选及其特征研究

内容摘要

全文目录

相似论文